Shrnutí na Tècniques de Producció Biotecnològica

## Introducción La tecnología del **ADN recombinante** permite insertar fragmentos de ADN que codifican un gen de interés dentro de un organismo huésped, con el objetivo de que este organismo exprese la proteína o rasgo deseado. Este proceso combina herramientas de biología molecular (enzimas de restricción, ligasas, vectores, métodos de introducción) y técnicas de selección para obtener clones recombinantes funcionales. ### ¿Por qué es importante? - Producción de proteínas terapéuticas (insulina, factores de crecimiento) - Desarrollo de cultivos y líneas celulares con rasgos mejorados - Investigación funcional de genes y vacunas recombinantes > Definición: Vector de clonación: Partes de ADN que pueden aceptar, transformar y replicar otras partes de ADN (por ejemplo, un plásmido). ## Conceptos básicos desglosados ### Componentes clave - **Gen de interés**: fragmento de ADN que codifica la proteína deseada. - **Vector de clonación**: molécula que transporta y replica el gen en la célula huésped (plásmidos, fagos, cósmidos, YAC, BAC). - **Organismo huésped**: célula que recibe y expresa el ADN recombinante (p. ej. Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, líneas de mamífero como CHO). - **Enzimas de restricción tipo II**: cortan el ADN en secuencias específicas (sitios de restricción). - **ADN ligasa**: une covalentemente los extremos de ADN para formar la molécula recombinante. > Definición: ADN recombinante: molécula de ADN creada artificialmente a partir de fragmentos con orígenes distintos. ### Pasos del proceso (secuencia típica) 1. Selección del organismo huésped y del vector de clonación. 2. Preparación del ADN a clonar: digestión con enzimas de restricción para aislar el gen. 3. Preparación del vector: digestión con los mismos enzimas para abrirlo. 4. Creación del ADN recombinante mediante ADN ligasa. 5. Introducción del vector recombinante en la célula huésped (transformación, transfección, microinyección, etc.). 6. Selección de organismos que contienen el ADN recombinante. 7. Expresión y obtención del producto codificado por el gen insertado. > Definición: Clon: copias idénticas de la molécula de ADN recombinante. ### Enzimas de restricción: características esenciales - Reconocen secuencias específicas (dianas), a menudo palindrómicas. - Se nombran según la bacteria de origen (p. ej. EcoRI). - Pueden producir extremos cohesivos ("pegajosos") o extremos romos. - Sólo cortan ADN no metilado; las bacterias protegen su ADN con metilasas asociadas. Tabla comparativa: tipos de vectores | Vector | Tamaño típico de inserto | Uso común | Ventajas | |---|---:|---|---| | Plásmido | hasta varios kb | clonación y expresión en bacterias | fácil de manipular, múltiples copias, marcadores de selección | | Fago | hasta ~10 kb | clonación y empaquetado viral | alta eficiencia de infección | | Cósmido | ~40 kb | inserciones medianas | combina características de fagos y plásmidos | | YAC (cromosoma artificial de levadura) | 100 kb - Mb | clonar fragmentos muy grandes | mantiene grandes inserciones | | BAC (cromosoma artificial bacteriano) | 100 kb - Mb | genómica, grandes insertos | estabilidad en bacterias | ### Plásmidos: por qué son útiles - Tamaño pequeño y fácil aislamiento. - ADN circular, mayor estabilidad. - Origen de replicación propio (ORI) que permite replicación independiente. - Puede haber alto número de copias por célula. - Contienen marcadores de selección (resistencia a antibióticos) y promotores para controlar la expresión. > Definición: Promotor: secuencia de ADN donde se une la ARN polimerasa; controla la expresión del gen. ### Promotores e inductores - El promotor actúa como "interruptor" ON/OFF de expresión génica. - Ejemplo: Operón lacZ regulado por IPTG; sin IPTG la proteína no se expresa. - Operón arabinosa: la proteína no se expresa si no hay arabinosa en el medio. Fun fact: ¿Sabías que muchos enzimas de restricción reconocen secuencias de 4 o 6 pares de bases y que existen más de 400 enzimas disponi