Tècniques de Producció Biotecnològica

Benvinguts a aquesta guia exhaustiva sobre les Tècniques de Producció Biotecnològica, amb una atenció especial en el cultiu i creixement de microorganismes. Aquest article està dissenyat per ajudar els estudiants a comprendre els conceptes fonamentals i a resoldre problemes pràctics relacionats amb la biotecnologia microbiana, cobrint des del càlcul del temps de generació fins a la quantificació de cultius cel·lulars. Aprofundirem en l'anàlisi de les diferents fases de creixement i els mètodes per mesurar la densitat cel·lular, proporcionant una base sòlida per a la vostra formació en aquest camp apassionant.

Fonaments de les Tècniques de Cultiu de Microorganismes: Creixement Bacterià i Llevats

El creixement microbià és un procés clau en les tècniques de producció biotecnològica. Implica l'augment de la biomassa o del nombre de cèl·lules en un cultiu. Per entendre'l, és fonamental conèixer conceptes com el temps de generació (g) i la velocitat específica de creixement (μ).

Problemes de Creixement Microbià i Càlcul de Paràmetres

Analitzem diversos escenaris per il·lustrar com es calculen aquests paràmetres essencials en el creixement microbià:

• Problema 1: Càlcul de cèl·lules cultivables al llarg del temps. Si un cultiu inicial de 10^4 ufc/mL amb un temps de generació de 2 hores, al cap de 4 h tindrà 3,99 x 10^4 ufc/mL; al cap de 24 h tindrà 4,09 x 10^7 ufc/mL; i al cap de 48 h arribarà a 1,67 x 10^11 ufc/mL.
• Problema 2: Determinació del temps de generació. Un cultiu amb una velocitat específica de creixement de 0,01 min^-1 té un temps de generació de 69,3 minuts (aproximadament 1,155 h).
• Problema 3: Concentració inicial per a una densitat final desitjada. Per aconseguir 10^8 cèl·lules/mL en 3 hores, amb un temps de generació de 30 minuts, la densitat cel·lular inicial hauria de ser de 1,56 x 10^6 cèl·lules/mL.
• Problema 4: Temps d'incubació necessari. Per passar de 10^6 cèl·lules/mL a 10^8 cèl·lules/mL en un cultiu amb un temps de generació de 30 minuts, es necessiten 3,323 hores d'incubació.
• Problema 5: Càlcul de μ i g a partir de dues densitats. Si un cultiu en fase exponencial passa de 10.000 cèl·lules/mL a 100.000.000 cèl·lules/mL en 4 hores, la velocitat específica de creixement (μ) és de 2,303 h^-1 i el temps de generació (g) és de 0,3 hores.
• Problema 6: Creixement amb fase de latència. Si 46 cèl·lules de Propionibacterium acnes (g=90 min, fase de latència=1,5 h) contaminen una paella, al cap de 10 hores hi haurà aproximadament 2,3 x 10^3 cèl·lules.
• Problema 7: Velocitat específica de creixement i concentració futura. Un cultiu bacterià que passa de 10^3 a 4000 bacteris/mL en 2 hores té una velocitat específica de creixement de 0,693 h^-1. Al cap de 5 hores, hi haurà 3,2 x 10^4 bacteris/mL.
• Problema 8: Creixement de llevats. Amb un temps de duplicació d'1 hora i 100 ufc/mL inicials, un cultiu de llevats tindrà 1,7 x 10^9 ufc/mL al cap de 24 hores.
• Problema 9: Temps de generació i nombre de generacions. Si un cultiu bacterià passa de 1000 a 100.000 bacteris en 4 hores de creixement exponencial, el temps de generació és de 36,1 minuts i s'han produït 6 generacions.
• Problema 10: Concentració inicial amb temps de generació conegut. Si després de 3 hores, un cultiu té 1,5 x 10^3 ufc/mL i el temps de generació és de 2 hores, la concentració inicial era de 530 ufc/mL.
• Problema 11: Càlcul de g i concentració inicial amb dues mesures. Si un cultiu bacterià té 2,8 x 10^3 ufc/mL després de 2 hores i 1,8 x 10^6 ufc/mL després de 15 hores, el temps de generació és de 1,394 hores i la concentració inicial era d'1 x 10^3 ufc/mL.

Anàlisi de Fases de Creixement en Bioreactors

En una fermentació, el creixement microbià no és constant i passa per diferents fases. Entendre aquestes fases és crucial per optimitzar la producció en biotecnologia.

Determinació de les Fases de Creixement

Considerem un exemple amb un bacteri aeròbic creixent en metanol, mesurant la concentració cel·lular (X) en g/L en diferents moments:

Les equacions de creixement, com X = X₀ · e^(μ(t-t₀)) o Ln X = Ln X₀ + μ(t-t₀), s'apliquen tant al nombre de bacteris (N) com al pes de bacteris (X).

• Fase de latència: Segons les dades, la fase de latència se situa entre 0 i 2 hores, on no hi ha un augment significatiu de la biomassa.
• Fase estacionària: La fase estacionària comença a partir de les 14 hores, moment en què el creixement s'estabilitza o disminueix.
• Fase exponencial: La fase de creixement exponencial, on el creixement és màxim i els valors s'ajusten a una funció exponencial, es produeix entre les 4 i les 14 hores. Durant aquesta fase:
• La velocitat específica de creixement (μ) és de 0,291 h^-1.
• El temps de generació (g) és de 2,38 hores.
• S'han produït aproximadament 4,2 generacions, és a dir, 4 generacions complertes.

Mètodes de Quantificació de Microorganismes en Biotecnologia

Quantificar la concentració de microorganismes és una tècnica fonamental per monitoritzar i controlar els processos biotecnològics. Hi ha diversos mètodes per fer-ho.

Dilucions Seriades i Recompte de Colònies (UFC/mL)

El mètode de dilucions seriades seguit de sembra en placa permet determinar el nombre d'Unitats Formadores de Colònies (UFC) per mil·lilitre. Aquesta tècnica és àmpliament utilitzada per la seva fiabilitat.

• Problema 1: Quantificació d'Escherichia coli
• a) Per què cal fer dilucions seriades? Cal fer-les per obtenir plaques amb un nombre de colònies comptable (generalment entre 30 i 300), evitant un recompte excessiu o la formació d'un cèrcol continu.
• b) Càlcul d'UFC/mL del cultiu inicial. A partir dels recomptes de les plaques (965 a 10^-1, 420 a 10^-2, 110 a 10^-3, 12 a 10^-4), prenent la dilució 10^-3 (110 ufc en 0,1 mL), la concentració inicial és de 1,1 x 10^6 ufc/mL (110 ufc / 0,1 mL * 10^3).
• c) Factor de dilució per a una nova suspensió. Per preparar una suspensió amb 1x10^5 ufc/mL a partir d'un cultiu de 1,1x10^6 ufc/mL, s'ha d'aplicar un factor de dilució d'aproximadament 1/11 (o diluir 10 vegades i ajustar).
• Problema 2: Quantificació de Bacillus subtilis
• a) Placa adequada per quantificar. Per a les dilucions de Bacillus subtilis (1200 a 10^-1, 210 a 10^-2, 33 a 10^-3, 5 a 10^-4), la placa de la dilució 10^-2 (210 ufc) és la més adequada, ja que es troba dins del rang ideal de recompte (30-300 colònies).
• b) Càlcul d'UFC/mL del cultiu inicial. Utilitzant la dilució 10^-2 (210 ufc en 0,1 mL), la concentració inicial és de 2,1 x 10^5 ufc/mL (210 ufc / 0,1 mL * 10^2).
• c) Dilució per obtenir 150 colònies. Per obtenir unes 150 colònies, considerant la concentració inicial, caldria sembrar una dilució de 10^-2 (ja que la 10^-2 va donar 210, una lleugera ajust seria necessària, però la 10^-2 és la més propera).

Mesura de l'Absorbància i Corbes de Calibratge

Un altre mètode de quantificació ràpid és la mesura de l'absorbància (densitat òptica) a 600nm, que es pot correlacionar amb la densitat cel·lular mitjançant una corba de calibratge.

• Problema 3: Corba de calibratge per McFarland
• La recta de regressió obtinguda és: y = 7,00 x 10^-10 · x + 0,15, on y és l'absorbància i x són les ufc/mL.
• a) Absorbància per a 8 x 10^8 ufc/mL. Si tenim 8 x 10^8 ufc/mL, l'absorbància seria: y = (7,00 x 10^-10 * 8 x 10^8) + 0,15 = 0,56 + 0,15 = 0,71.
• b) Concentració per a una absorbància de 0,153. Si una suspensió presenta una absorbància de 0,153, la concentració seria: 0,153 = 7,00 x 10^-10 * x + 0,15. Resolent per x, 0,003 = 7,00 x 10^-10 * x, de manera que x = 0,003 / (7,00 x 10^-10) = 4,28 x 10^6 ufc/mL.
• c) Concentració per a una absorbància de 2,1. Si una suspensió d'E. coli té una absorbància de 2,1, la concentració seria: 2,1 = 7,00 x 10^-10 * x + 0,15. Resolent per x, 1,95 = 7,00 x 10^-10 * x, de manera que x = 1,95 / (7,00 x 10^-10) = 2,78 x 10^9 ufc/mL.
• d) Densitat cel·lular de mostra inicial diluïda. Si una suspensió de Bacillus subtilis diluïda 1/10 mostra una absorbància de 0,484, primer calculem la concentració de la mostra diluïda: 0,484 = 7,00 x 10^-10 * x + 0,15. Resolent per x, 0,334 = 7,00 x 10^-10 * x, de manera que x = 0,334 / (7,00 x 10^-10) = 4,77 x 10^8 ufc/mL. Com que la mostra estava diluïda 1/10, la densitat cel·lular de la mostra inicial era de 4,77 x 10^8 * 10 = 4,77 x 10^9 ufc/mL.

Preguntes Freqüents sobre Tècniques de Producció Biotecnològica per a Estudiants

Què és el temps de generació en microbiologia i com es calcula?

El temps de generació (g) és el temps que triga una població microbiana a duplicar-se. Es calcula dividint el logaritme natural de 2 (0,693) per la velocitat específica de creixement (μ), és a dir, g = 0,693 / μ. També es pot determinar a partir de dues concentracions cel·lulars mesurades en diferents moments de la fase exponencial.

Per què són importants les dilucions seriades en la quantificació de microorganismes?

Les dilucions seriades són essencials per reduir la concentració de microorganismes a un nivell que permeti un recompte precís de colònies en una placa de cultiu. Sense elles, la placa estaria massa saturada de colònies per ser comptada individualment, o el creixement podria ser confluent, impedint una quantificació fiable.

Quines fases de creixement té un cultiu bacterià i què caracteritza cadascuna?

Un cultiu bacterià típic passa per quatre fases: fase de latència (adaptació sense divisió), fase exponencial (creixement ràpid i constant), fase estacionària (creixement nul per equilibri entre divisions i morts cel·lulars o per limitació de nutrients) i fase de declivi o mort (disminució del nombre de cèl·lules viables).

Com es pot utilitzar l'absorbància per quantificar la densitat cel·lular?

L'absorbància, o densitat òptica, mesura la quantitat de llum que és absorbida per una suspensió cel·lular a una longitud d'ona específica (com 600 nm). Com més cèl·lules hi hagi, més llum s'absorbeix. Per convertir l'absorbància en densitat cel·lular (ufc/mL), es crea una corba de calibratge prèvia mesurant l'absorbància de suspensions amb concentracions cel·lulars conegudes.