Podcast o Základy Biochemického Inžinierstva

Kapitoly

Mýtus o nudnej bilancii

Zákon zachovania hmotnosti

Ustálený stav

Čo je to fermentor?

Miešanie je veda

Kyslík nad zlato

Sterilita nadovšetko

Filtrácia ako alternatíva

Ako bunky vlastne umierajú

Matematika prežitia

D-hodnota, Z-hodnota a F-hodnota

Rýchlosť rastu a Monodov model

Keď je dobrého priveľa

Kedy vzniká produkt?

Zhrnutie a záver

Přepis

Šimon: Väčšina študentov si myslí, že hmotnostná bilancia je len nejaká abstraktná teória. Ale v skutočnosti je to skôr ako detektívka – nič sa nestratí, len to zmení formu.

Natália: Presne tak! Je to jeden zo základných kameňov chémie aj fyziky. Počúvate Studyfi Podcast, kde sa pozrieme na to, prečo je to dôležité.

Šimon: Dobre, tak kde začať? Čo je ten kľúčový princíp, ktorý sa nesmie stratiť?

Natália: Ten kľúčový princíp je geniálne jednoduchý a pochádza od Lavoisiera. Hovorí, že v uzavretom systéme sa hmota nemôže ani vytvoriť, ani zničiť. Iba sa premieňa.

Šimon: Takže... čo do systému vojde, musí z neho aj vyjsť, alebo tam zostať?

Natália: Bingo! Základná bilančná rovnica je: VSTUP sa rovná VÝSTUP plus to, čo sa v systéme nahromadí, teda akumulácia.

Šimon: Akumulácia? To znie... komplikovane.

Natália: Vôbec nie. Predstav si vaňu s otvoreným odtokom. Ak do nej napúšťaš vodu presne tak rýchlo, ako odteká, hladina sa nemení. To je ustálený stav a akumulácia je nulová.

Šimon: Aha! Takže VSTUP sa rovná VÝSTUP. To je oveľa jednoduchšie.

Natália: Presne. A práve tento jednoduchý princíp je základom pre výpočty v obrovských priemyselných procesoch. Ale o tom nabudúce.

Šimon: Dobre, takže už vieme, ako bunky fungujú, ale kde sa to celé vlastne odohráva? Nemôžu si len tak plávať v nejakej obyčajnej nádobe, však?

Natália: To teda nemôžu. Potrebujú svoje vlastné luxusné bývanie. A tým je fermentor.

Šimon: Fermentor... to znie ako niečo zo sci-fi filmu.

Natália: Trochu aj je! Predstav si ho ako super-inteligentný, uzavretý hrniec. Jeho úlohou je vytvoriť pre bunky dokonalé prostredie. Vie presne regulovať teplotu, pH, a hlavne množstvo rozpusteného kyslíka.

Šimon: A ako to robí? Má nejaké špeciálne nástroje?

Natália: Presne tak. Má miešací systém s motorom, tepelný plášť na chladenie alebo ohrev, prívod vzduchu cez sterilný filter a, samozrejme, kopu senzorov, ktoré všetko neustále sledujú.

Šimon: Spomenula si miešanie. To je len aby sa to nepripálilo ako nedeľná polievka?

Natália: Skoro! Cieľom je rovnomerne rozptýliť bunky a živiny, a čo je kľúčové, efektívne dostať kyslík z bubliniek do kvapaliny. Štandardom sú mechanicky miešané reaktory, takzvané STR.

Šimon: Takže tam je proste nejaká vrtuľa?

Natália: V podstate áno, ale je to celá veda! Máme rôzne typy miešadiel. Niektoré sú ako turbína pre vysoký prenos plynu, iné sú šetrnejšie k bunkám. A aby sa neurobil jeden veľký vír, na stenách sú zarážky, ktoré to celé rozbíjajú a zlepšujú premiešavanie.

Šimon: Dobre, chápem. A neustále spomínaš kyslík. Prečo je taký dôležitý?

Natália: Pretože pri aeróbnych procesoch je kyslík limitujúcim faktorom. Bunky ho potrebujú dýchať, ale jeho rozpustnosť vo vode je dosť nízka. Úlohou inžiniera je zabezpečiť, aby rýchlosť, akou dodávame kyslík, bola rovnaká ako rýchlosť, akou ho mikróby spotrebúvajú.

Šimon: Takže je to taký neustály pretek v doplňovaní kyslíka?

Natália: Presne tak! A celé je to o maximalizácii prestupu. To dosiahneme napríklad vyššími otáčkami miešadla alebo aktívnym vháňaním vzduchu cez špeciálny rozprašovač na dne nádoby.

Šimon: A čo kontaminácia? Predpokladám, že tam nechceme mať žiadnych neželaných hostí.

Natália: Absolútne nie. A tu je tá prekvapivá časť... nikdy si nemôžeme byť stopercentne istí, že je systém sterilný. Pracujeme s matematickou pravdepodobnosťou.

Šimon: Čože? Takže len dúfame, že to vyjde?

Natália: Nie tak celkom. Štandard je extrémne prísny. Volá sa to Sterility Assurance Level, alebo SAL. Požaduje sa úroveň, ktorá znamená, že štatisticky by sme našli preživší mikroorganizmus maximálne v jednej z milióna nádob.

Šimon: Páni. A ako sa to dosiahne?

Natália: Najčastejšie metódou Steam-In-Place, alebo SIP. Do celého systému sa pustí horúca para s teplotou 121 stupňov na asi 20 minút, čo zničí prakticky všetko živé.

Šimon: Takže fermentor je vlastne taký high-tech tlakový hrniec pre mikróby, kde je kľúčové miešanie, dýchanie a extrémna čistota. Fascinujúce. A čo sa stane, keď bunky dorastú?

Šimon: Jasné, takže vysoká teplota je super účinná. Ale čo keď máme v médiu látky, ktoré by sme tou teplotou zničili? Napríklad vitamíny alebo antibiotiká ako penicilín?

Natália: Výborná otázka, Šimon. Na takéto termolabilné, teda na teplo citlivé látky, máme iný trik. Volá sa to sterilná filtrácia.

Šimon: Znie to ako... extrémne jemné sitko.

Natália: V podstate presne tak! Používame špeciálny filter s pórmi o veľkosti len 0,22 mikrometra. To je také malé, že tekutina s vitamínmi prejde, ale baktérie a huby sa na ňom mechanicky zachytia.

Šimon: Takže ich vlastne len odfiltrujeme preč. Šikovné. Funguje to aj na niečo iné?

Natália: Áno, podobne sa filtrujú aj plyny. Napríklad vzduch, ktorý vháňame do bioreaktora, prechádza cez špeciálne PTFE filtre, aby bol dokonale sterilný.

Šimon: Dobre, takže máme teplo, žiarenie, filtráciu... ale čo sa presne deje s tou baktériou, keď ju zabíjame? Čo ju vlastne položí na lopatky?

Natália: Sú tri hlavné spôsoby. Pri vlhkom teple, ako v autokláve, ide o denaturáciu proteínov. Vysoká teplota v podstate „uvarí“ enzýmy v bunke, zmení ich tvar a prestanú fungovať.

Šimon: Takže bunke uvaríme večeru z jej vlastných enzýmov.

Natália: Presne tak. Druhý spôsob je poškodenie membrány. To robia napríklad alkoholy pri dezinfekcii. Rozbijú tú tukovú vrstvu bunky a ona jednoducho „vytečie“.

Šimon: A ten tretí?

Natália: To je rozbíjanie DNA. To spôsobuje napríklad gama žiarenie, ktorým sa sterilizujú jednorazové plastové veci. Žiarenie naseká DNA na malé kúsky a bunka sa už nedokáže opraviť ani množiť.

Šimon: OK, tomu rozumiem. Ale prečo to tak komplikovane počítame? Nemôžeme proste nastaviť autokláv na maximálnu teplotu a nechať to tam pol dňa, aby sme mali istotu?

Natália: To by sme si zničili aj živné médium. Všetky tie dôležité cukry a aminokyseliny by sme spálili. Cieľom je zabiť mikróby, ale zachovať médium neporušené. Preto potrebujeme presne vypočítať, koľko tepla a času je nevyhnutných. A na to máme tri kľúčové hodnoty.

Šimon: D, Z a F? Znie to ako tajný kód.

Natália: Je to jednoduchšie, než to znie. Prvá je D-hodnota. To je čas v minútach, za ktorý pri konštantnej teplote zabijeme presne 90 % mikróbov.

Šimon: Počkaj, len 90 %? To mi neznie veľmi sterilne.

Natália: Je to len miera. Znamená to zníženie ich počtu o jeden rád. Ak chceš znížiť počet baktérií z miliardy na jednu, potrebuješ deväť takýchto D-cyklov. Takže ak je D-hodnota pri 121 stupňoch 1,5 minúty, celý proces bude trvať 9 krát 1,5, teda 13,5 minúty.

Šimon: A na čo je potom Z-hodnota?

Natália: Z-hodnota hovorí, o koľko stupňov Celzia musíme zvýšiť teplotu, aby sa D-hodnota znížila desaťkrát. Pri vlhkom teple je to typicky 10 °C. Takže ak pri 121 stupňoch trvá zabíjanie 1,5 minúty, pri 131 stupňoch to bude trvať už len 0,15 minúty.

Šimon: Aha, takže to ukazuje, ako veľmi teplota zrýchľuje zabíjanie. A posledná je F-hodnota, však?

Natália: Presne. F-hodnota, alebo letalita, je kumulatívny účinok celého procesu – vrátane ohrevu a chladenia. Povie nám, akoby dlho musel byť materiál vystavený teplote 121 stupňov, aby sme dosiahli rovnaký výsledok. A vždy sa meria na takzvanom „studenom bode“, teda na najchladnejšom mieste v systéme.

Šimon: Takže sterilizácia je v skutočnosti precízna veda, nie len hrubá sila. To je fascinujúce. A keď už máme takto dokonale pripravené sterilné prostredie, môžeme sa pozrieť na hlavných hráčov v našom procese – samotné enzýmy.

Šimon: A sme vo finále! Prešli sme si všetkým od enzýmov až po metabolické dráhy. Poslednou zastávkou je... mikrobiálna kinetika. Priznám sa, znie to trochu odstrašujúco.

Natália: To je častá reakcia! Ale neboj sa, je to len spôsob, ako matematikou opísať to, čo mikróby robia. Predstav si to ako predpoveď počasia pre baktérie. Pomáha nám to odhadnúť, ako sa bude biomasa správať v čase.

Šimon: Takže predpovedáme, či budú mať baktérie „slnečný deň“ s množstvom potravy?

Natália: Presne tak! A kľúčovým pojmom je špecifická rastová rýchlosť, označená ako µ. Jednoducho hovorí, ako rýchlo sa bunky delia. Vysoké µ znamená, že majú párty a rýchlo sa množia. Nízke µ znamená, že sú lenivé a rastú pomaly.

Šimon: A čo túto rýchlosť ovplyvňuje? Predpokladám, že jedlo.

Natália: Správne! A na to máme Monodov model. Ten hovorí jednoduchú vec: čím viac živín, teda substrátu, bunky majú, tým rýchlejšie rastú. Ale... len do určitého bodu. Keď už majú živín dosť, rýchlejšie to nejde, aj keby si im dal viac. Dosiahnu svoju maximálnu rýchlosť.

Šimon: Takže je to ako all-you-can-eat bufet. V určitom bode už proste viac nezješ.

Natália: Perfektné prirovnanie! A presne ako v bufete, niekedy ti príliš veľa jedla môže uškodiť. A na to nadväzuje Haldaneov model.

Šimon: Počkaj, ako môže baktériám uškodiť priveľa potravy?

Natália: Niektoré látky, napríklad etanol, fenol alebo aj niektoré cukry vo veľmi vysokých koncentráciách, sú pre bunky toxické. Spomaľujú ich rast. Haldaneov model teda rozširuje ten Monodov a pridáva faktor inhibície. Trocha substrátu pomáha, ale príliš veľa škodí.

Šimon: Rozumiem. Takže kinetika nám pomáha nájsť ten „zlatý stred“ – ani málo, ani veľa.

Natália: Presne tak. Je to o optimalizácii. A to platí nielen pre rast, ale aj pre tvorbu produktov.

Šimon: Čo tým myslíš? Ako napríklad pri výrobe antibiotík alebo alkoholu?

Natália: Áno. Na to používame Luedeking-Piretov model. Ten nám pomáha zistiť, či sa produkt tvorí počas rastu buniek, alebo až po ňom. Máme primárne metabolity, ako etanol, ktoré vznikajú, keď bunky rastú. A potom sekundárne, ako antibiotiká, ktoré sa tvoria, až keď bunky prestanú rásť a sú v strese.

Šimon: Aha! Takže najprv si musíme „vypestovať“ armádu buniek, a až potom ich donútiť, aby vyrábali to, čo chceme.

Natália: Vystihol si to! A aby to nebolo jednoduché, bunky spotrebúvajú energiu nielen na rast a produkciu, ale aj na svoju základnú údržbu. To opisuje Pirtov vzťah. Aj keď bunka nerastie, stále musí opravovať DNA a udržiavať membrány. Je to ako auto, ktoré spotrebúva benzín, aj keď stojí na mieste so zapnutým motorom.

Šimon: Wow, takže tých modelov je viacero. Každý na niečo iné. To je skvelý prehľad, Natália. Myslím, že si nám mikrobiálnu kinetiku naozaj skvele demystifikovala.

Natália: Rada som pomohla! Kľúčové je vybrať si správny model podľa toho, čo chceme vedieť. Či nás zaujíma len rast, inhibícia, alebo tvorba produktu.

Šimon: Úžasné. Týmto sme na konci nášho dnešného dielu a vlastne aj celej našej série o biotechnológiách. Natália, veľmi ti ďakujem za všetky tvoje vedomosti a čas. Verím, že to našim poslucháčom pomohlo.

Natália: Aj ja ďakujem za pozvanie, Šimon. Bola to radosť. A všetkým poslucháčom držím palce pri štúdiu!

Šimon: Tak teda, za celý tím Studyfi Podcastu vám ďakujeme za počúvanie a prajeme veľa úspechov. Majte sa krásne a dopočutia!