Zhrnutie na Techniky izolácie leukocytov z krvi

## Úvod Magnetická separácia buniek je rýchla a špecifická metóda na obohatenie alebo odstránenie určitej subpopulácie buniek z bunkovej suspenzie pomocou magnetických častíc označených protilátkami. Využíva sa pri príprave vzoriek pre ďalšie imunologické, cytologické alebo funkčné testy. > Definícia: Magnetická separácia buniek je technika, pri ktorej sa bunky označia protilátkami naviazanými na magnetické častice a následne sa separujú pôsobením vonkajšieho magnetického poľa. ## Základné princípy a rozdelenie metódy ### 1) Priamy a nepriamy spôsob označenia - Priama selekcia: magnetické častice sú priamo konjugované s protilátkou proti cieľovým antigénom. - Nepriama selekcia: bunky sa najprv označia mAb voči cieľovému CD antigénu a následne sa použijú magnetické častice viazané na anti-globulín, ktoré sa naviažu na primárnu protilátku. > Definícia: Pozitívna selekcia znamená zachytenie cieľových buniek priamo na magnetických časticiach; negatívna selekcia znamená odstránenie alebo depleciu nežiaducich buniek, pričom cieľová populácia zostáva vo volante. ### 2) Pozitívna vs. negatívna selekcia | Kritérium | Pozitívna selekcia | Negatívna selekcia | |---|---:|---:| | Označenie buniek | Priame viazanie na cieľové bunky | Odstránenie nežiaducich buniek | Výsledná čistota | Vysoká pre cieľovú populáciu | Dobre zachované nativné vlastnosti cieľových buniek | Aplikácie | Izolácia vzácnych fenotypov | Pri príprave funkčných testov citlivých na manipuláciu ## Potrebné prístroje a materiál - Centrifúga s adaptérom pre skúmavky - Držiak s magnetom (stojan pre skúmavky) - Magnetické častice konjugované s mAb alebo anti-globulínom - Premývací pufor: FFR s 0,1% NaN3 a 0,1% BSA - Eppendorfové skúmavky (2 ml) - Automatická mikropipeta (200 µl) a jednorazové špičky ## Podrobný postup (skúmavková metóda) 1. Príprava bunkovej suspenzie: resuspendujeme bunky na koncentráciu približne $1\times10^{7}$ leukocytov/ml. 2. Odstreďovanie a resuspenzia: po centrifugácii resuspendujeme sediment v $200\ \mu$l premývacieho pufru. 3. Pridanie magnetických častíc: pridáme odporučené množstvo častíc konjugovaných s mAb. 4. Inkubácia: inkubujeme pri teplote $2\text{–}8\ ^\circ\mathrm{C}$ počas $20$ minút (pozitívna selekcia) alebo $30$ minút (negatívna selekcia). 5. Riedenie: pridáme $1{,}5\ \mathrm{ml}$ premývacieho pufru. 6. Magnetická separácia: vložíme skúmavku do držiaka s magnetom a inkubujeme $3\text{–}5$ minút. 7. Odstránenie supernatantu: kým je skúmavka v magnetickom poli, vylejeme supernatant obsahujúci neprichytené bunky. 8. Premývanie: magnetom zachytené bunky premyjeme premývacím pufrom trikrát (opakujeme kroky 5–7). 9. Resuspenzia: izolované bunky resuspendujeme v malom objeme ($0{,}5\ \mathrm{ml}$) Hanksovho roztoku alebo kompletného kultivačného média pripraveného pre ďalšie použitie. > Tip: Pri manipulácii pracujte opatrne po stene skúmavky, aby sa minimálne premiešalo viazané frakcie so separačnou tekutinou. ## Alternatívny postup: odstránenie erytrocytov hypotonickou lýzou 1. Zmiešame $2\ \mathrm{ml}$ krvi so $4\ \mathrm{ml}$ destilovanej vody a inkubujeme $35\text{–}40$ sekúnd, čím dochádza k osmotickej lýze erytrocytov. 2. Pridáme $2\ \mathrm{ml}$ roztoku $2{,}7\%$ NaCl, čím obnovíme izotonické podmienky (pomer krvi : destilovaná voda : $2{,}7\%$ NaCl je $1:2:1$). 3. Centrifugujeme $10$ minút pri $400\times g$ a vylejeme supernatant. 4. Sediment resuspendujeme v $10\ \mathrm{ml}$ FFR alebo Hanksovho roztoku a centrifugujeme znova $10$ minút pri $400\times g$. Tento krok zopakujeme ešte dvakrát. 5. Po poslednom premytí resuspendujeme sediment v $0{,}5\text{–}1\ \mathrm{ml}$ Hanksovho roztoku. ## Hodnotenie výsledku a ďalšie použitie - Stanovíme koncentráciu a životnosť izolovaných leukocytov podľa bežných laboratórnych postupov. - Z $1\ \mathrm{ml}$ krvi možno získať približne $10^{6}$ buniek s $95\text{–}98\%$ životnosťou (závisí od druhu darcu a kvality vzorky). - Izolované bunky sa používajú napríklad na funkčné testy, cytomet