Techniky izolácie leukocytov z krvi

Izolácia leukocytov z krvi je kľúčovou metódou v medicínskych a výskumných laboratóriách. Tento článok poskytuje komplexný rozbor rôznych techník izolácie leukocytov z krvi, ktoré sú rozdelené na imunologicky nešpecifické a imunologicky špecifické prístupy. Pochopenie týchto metód je nevyhnutné pre študentov a odborníkov v oblasti imunológie a hematológie.

Leukocyty sa najčastejšie izolujú z periférnej krvi odobratej do skúmavky s antikoagulačným roztokom, ako je EDTA, heparín alebo citrát sodný. Výber vhodnej techniky závisí od požadovaného typu leukocytov a následného použitia izolovaných buniek.

Základné princípy izolácie leukocytov z krvi

Metódy izolácie leukocytov môžeme rozdeliť na dve hlavné kategórie:

• Imunologicky nešpecifické separačné metódy: Tieto metódy sú založené na rozdieloch vo fyzikálnych vlastnostiach buniek, ako je odolnosť voči hypotonickému tlaku alebo denzita buniek, a tiež na rozdielnych funkciách, napríklad adherencii.
• Imunologicky špecifické separačné postupy: Využívajú prítomnosť špecifických CD antigénov zabudovaných v membráne cieľovej populácie buniek. Tieto antigény rozpoznávajú špecifické monoklónové protilátky, čo umožňuje presnú selekciu alebo odstránenie konkrétnej bunkovej subpopulácie.

Izolácia leukocytov lýzou erytrocytov destilovanou vodou

Táto jednoduchá metóda využíva časovo limitované pôsobenie hypotonického roztoku (destilovanej vody) na selektívne odstránenie erytrocytov. Leukocyty sú voči hypotonickému prostrediu odolnejšie.

Prístroje a materiály:

• Centrifúga, mikroskop, Bürkerova komôrka
• 3–4 ml nezrazenej krvi (s 1,5 % EDTA)
• Destilovaná voda, 2,7 % NaCl (hypertonický roztok)
• Fosfátový fyziologický roztok (FFR), Hanksov roztok pH 7,2–7,4
• 0,5 %-ný roztok trypanovej modrej
• Sterilné plastové skúmavky (10 ml), pipety (10 ml), automatická mikropipeta (200 µl)

Postup:

1. Zmiešajte 2 ml krvi so 4 ml destilovanej vody. Pomer krvi, destilovanej vody a 2,7 % NaCl je 1:2:1.
2. Inkubujte 35-40 sekúnd, počas ktorých dochádza k osmotickej lýze erytrocytov.
3. Pridajte 2 ml 2,7 % roztoku NaCl na obnovenie izotonického prostredia.
4. Vzorku centrifugujte 10 minút pri 400 x g (1400 rpm). Supernatant vylejte.
5. Sediment buniek resuspendujte v 10 ml FFR alebo Hanksovho roztoku a znovu centrifugujte 10 minút pri 400 x g (1400 rpm). Tento krok zopakujte ešte dvakrát na odstránenie hemoglobínu a zvyškov poškodených erytrocytov.
6. Po poslednom premytí sediment leukocytov resuspendujte v malom objeme (0,5 – 1 ml) Hanksovho roztoku.

Hodnotenie výsledku: Stanoví sa koncentrácia a životnosť izolovaných leukocytov. Z 1 ml krvi možno získať ~10⁶ buniek s 95-98 % životnosťou. Tieto leukocyty sú vhodné napríklad na testovanie metabolického vzplanutia fagocytujúcich leukocytov (INT test).

Izolácia leukocytov lýzou erytrocytov lyzačným roztokom

Tento postup využíva chemickú lýzu membrán erytrocytov špeciálnym lyzačným roztokom, ktorý nepoškodzuje leukocyty. Často sa používa po označovaní leukocytov pre analýzu v prietokovom cytometri.

Prístroje a materiály:

• Centrifúga, mikroskop, Bürkerova komôrka
• 1–2 ml nezrazenej krvi
• Lyzačný roztok, FFR, Hanksov roztok pH 7,2–7,4, 0,5 %-ný roztok trypanovej modrej
• Sterilné plastové skúmavky (10 ml), pipety (10 ml), automatická mikropipeta (200 µl)

Postup:

1. Zmiešajte 1 ml krvi s 5 ml lyzačného roztoku.
2. Inkubujte 10–15 minút, počas ktorých dochádza k lýze erytrocytov.
3. Vzorku centrifugujte 10 minút pri 400 x g (1400 rpm). Supernatant vylejte.
4. Sediment buniek resuspendujte v 10 ml FFR alebo Hanksovho roztoku a znovu centrifugujte 10 minút pri 400 x g (1400 rpm). Tento krok zopakujte ešte dvakrát.
5. Po poslednom premytí sediment leukocytov resuspendujte v malom objeme (0,5 – 1 ml) Hanksovho roztoku.

Hodnotenie výsledku: Rovnako ako pri predchádzajúcej metóde sa stanoví koncentrácia a životnosť izolovaných leukocytov.

Izolácia mononukleárnych leukocytov zo krvi

Táto metóda je založená na rozdielnej denzite krvných buniek a využíva separačné tekutiny so špecifickou hustotou (napríklad Histopaque1077, Ficoll-Hypaque). Lymfocyty a monocyty (mononukleárne leukocyty – MNL) majú nižšiu denzitu ako táto tekutina a po centrifugácii vytvoria prstenec (interfázu), zatiaľ čo granulocyty a erytrocyty sedimentujú.

Postup izolácie MNL z cicavčej krvi

Prístroje a materiály:

• Centrifúga, mikroskop, Bürkerova komôrka
• 2 ml nezrazenej krvi
• Separačná tekutina so špecifickou hustotou 1,077 g/cm³
• FFR, Hanksov roztok pH 7,2–7,4, Kompletné kultivačné médium (KKM), 0,5 %-ný roztok trypanovej modrej

Postup:

1. Zmiešajte 2 ml krvi s 2 ml FFR.
2. Do skúmavky dajte 3 ml separačnej tekutiny.
3. Na separačnú tekutinu opatrne, pomocou injekčnej striekačky a ihly po stene skúmavky, navrstvite zriedenú vzorku krvi. Krv sa nesmie zmiešať so separačnou tekutinou.
4. Vzorku centrifugujte 20 minút pri 900 x g (2200 rpm). Biela vrstva v interfáze sú MNL a trombocyty; na dne skúmavky sú erytrocyty a PMNL.
5. Pomocou injekčnej striekačky a ihly odsajte prstenec MNL.
6. Odsaté bunky prenesiete do novej skúmavky, pridajte k nim päťnásobné množstvo FFR alebo Hanksovho roztoku a suspenziu centrifugujte 10 minút pri 400 x g (1400 rpm).
7. Supernatant vylejte. Sediment MNL opäť premyte vo FFR alebo Hanksovom roztoku a vzorku centrifugujte 10 minút pri 400 x g (1400 rpm). Tento krok sa zopakuje ešte dvakrát.
8. Po poslednom premytí sediment buniek resuspendujte v malom objeme (0,5 – 1 ml) Hanksovho roztoku alebo KKM.

Hodnotenie výsledku: Stanoví sa koncentrácia a životnosť izolovaných leukocytov.

Postup izolácie MNL z krvi vtákov

Pri izolácii MNL z krvi vtákov sa používa podobný postup, avšak s dvoma separačnými tekutinami s rôznou špecifickou hustotou.

Postup:

1. Zmiešajte 2 ml krvi s 2 ml FFR.
2. Do skúmavky dajte najprv 3 ml separačnej tekutiny s hustotou 1,119 g/cm³.
3. Túto tekutinu opatrne prevrstvite 3 ml separačnej tekutiny s hustotou 1,077 g/cm³.
4. Na separačnú tekutinu opatrne navrstvite zriedenú vzorku krvi. Krv sa nesmie zmiešať so separačnou tekutinou.
5. Vzorku centrifugujte 40 minút pri 300 x g (1200 rpm). Následný postup je rovnaký ako pri izolácii MNL z krvi cicavcov (odsatie prstenca MNL a trojnásobné premytie).

Magnetická separácia leukocytov

Táto vysoko špecifická technika je založená na použití magnetických častíc označených monoklónovými protilátkami proti membránovým antigénom cieľovej subpopulácie leukocytov. Pomocou magnetického poľa je možné buď získať (pozitívna selekcia) alebo odstrániť (negatívna selekcia) hľadanú subpopuláciu buniek.

Princíp metódy: Magnetické častice konjugované s monoklónovými protilátkami sa naviažu na špecifické CD antigény na povrchu buniek. Po inkubácii sa takto označené bunky oddelia od ostatných pomocou silného magnetického poľa.

Protokol skúmavkovej metódy magnetickej separácie

Prístroje a materiály:

• Centrifúga, držiak s magnetom
• Magnetické častice konjugované s protilátkou špecifickou pre cieľové bunky
• Premývací roztok: FFR s 0,1% azidom sodným, 0,1% BSA
• Eppendorfové skúmavky (2 ml), automatická mikropipeta (200 µl)

Postup:

1. Pripravte bunkovú suspenziu s koncentráciou približne 1 × 10⁷ leukocytov/ml.
2. Bunky po centrifugácii resuspendujte v 200 µl premývacieho pufru.
3. Pridajte magnetické častice konjugované s monoklónovou protilátkou.
4. Inkubujte pri teplote 2–8 °C 20 minút (pre pozitívnu izoláciu) alebo 30 minút (pre negatívnu selekciu).
5. Pridajte 1,5 ml premývacieho pufru a skúmavku vložte do držiaka s magnetom. Inkubujte 3–5 minút.
6. Kým je skúmavka v magnetickom poli, vylejte supernatant aj s neprichytenými bunkami.
7. Magnetom prichytené bunky 3-krát premyte premývacím pufrom (opakujte kroky 5 až 7).
8. Izolované bunky resuspendujte v malom objeme (0,5 ml) Hanksovho roztoku alebo kompletného kultivačného média.

Nepriama metóda magnetickej separácie: Ak priama metóda nie je možná (napr. pre krv vtákov), použije sa nepriama metóda. Hľadané bunky sa najprv označia monoklónovou protilátkou proti ich špecifickému CD antigénu a následne sa odseparujú pomocou magnetických častíc označených sekundárnou anti-globulínovou protilátkou.

Ďalšie špecifické metódy

Medzi ďalšie špecifické metódy patrí separácia pomocou prietokového cytometra – FACS. Táto metóda využíva optickú aktiváciu buniek s naviazanými špecifickými protilátkami označenými fluorochrómami v prúde laserového lúča. Takto označené bunky sú usmernené v elektrickom poli, čo vedie k ich oddeleniu. Viac o FACS nájdete na Wikipedia.

Záver k technikám izolácie leukocytov

Výber správnej techniky izolácie leukocytov je kľúčový pre presnosť a spoľahlivosť ďalších imunologických a bunkových analýz. Každá metóda má svoje výhody a je určená pre špecifické aplikácie, čo umožňuje vedcom a diagnostikom získať čisté populácie buniek pre rôzne výskumné a klinické účely.

Často kladené otázky študentov

Na akom princípe funguje izolácia leukocytov pomocou destilovanej vody?

Táto metóda využíva rozdielnu odolnosť buniek voči hypotonickému tlaku. Destilovaná voda ako hypotonický roztok spôsobuje osmotickú lýzu erytrocytov, ktoré sú citlivejšie, zatiaľ čo leukocyty zostávajú nepoškodené. Následne sa izotonické prostredie obnoví pridaním hypertonického roztoku NaCl.

Aký je rozdiel medzi izoláciou MNL z cicavčej a vtáčej krvi?

Hlavný rozdiel spočíva v počte a špecifickej hustote separačných tekutín. Pre cicavčiu krv sa zvyčajne používa jedna separačná tekutina (napr. s hustotou 1,077 g/cm³). Pre vtáčiu krv je potrebná dvojvrstvová separačná tekutina, kde sa najprv navrství tekutina s hustotou 1,119 g/cm³ a na ňu tekutina s hustotou 1,077 g/cm³ pred navrstvením krvi. Dôvodom sú odlišné denzitné charakteristiky krvných buniek vtákov.

Prečo sa pri magnetickej separácii používa pozitívna a negatívna selekcia?

Pozitívna selekcia slúži na získanie hľadanej populácie buniek, ktoré sa naviažu na magnetické častice a sú priťahované magnetom. Negatívna selekcia sa používa na odstránenie nežiaducej populácie buniek, ktoré sa naviažu na magnetické častice a sú odseparované, zatiaľ čo hľadané bunky zostávajú v supernate.

Aké sú výhody magnetickej separácie oproti iným metódam?

Magnetická separácia je vysoko špecifická a efektívna metóda, ktorá umožňuje izoláciu konkrétnych subpopulácií leukocytov na základe ich membránových antigénov. Je relatívne jednoduchá a rýchla, a zároveň umožňuje získať čisté bunkové populácie s vysokou životnosťou. Menej ovplyvňuje bunkovú viabilitu ako niektoré iné metódy, čo je dôležité pre následné testovanie.

Čo je potrebné zohľadniť pri výbere antikoagulantu pre odber krvi?

Pri výbere antikoagulantu je dôležité zohľadniť účel ďalších testov. Napríklad EDTA sa bežne používa, ale môže ovplyvniť niektoré bunkové funkcie. Heparín je často vhodný pre funkčné testy leukocytov, zatiaľ čo citrát sodný sa používa pre testy koagulácie. Každý antikoagulant má svoje špecifiká a môže ovplyvniť viabilitu a funkčnosť izolovaných leukocytov.