Resumen de Secuenciación del Genoma y Genómica

## Introducción La **secuenciación genómica** estudia cómo obtener y analizar la secuencia del ADN a escala de genomas completos. Permite identificar genes, variantes, estructuras genómicas y comparar genomas para entender funciones biológicas y aplicaciones médicas, agrícolas y ecológicas. > Definición: La secuenciación genómica es el conjunto de técnicas y procesos destinados a determinar el orden de los nucleótidos en el ADN de un organismo y a analizar esa información a nivel de genoma completo. ## Panorama general: fases de la genómica 1. **Obtención de la secuencia**: preparación de muestras, elección de tecnología, generación de lecturas. 2. **Análisis de la secuencia**: control de calidad, filtrado, alineamiento. 3. **Análisis del genoma**: ensamblaje, anotación genómica. 4. **Análisis comparativo**: comparación entre genomas, filogenia, detección de synteny. 5. **Genómica funcional**: vincular secuencia con función molecular y fenotipos. ## Tecnologías de secuenciación: generaciones ### Primera generación - **Secuenciación química (Maxam-Gilbert)** - **Método Sanger** (didesoxinucleótidos, ddNTPs) - **Terminadores fluorescentes** (dye terminators, Leroy-Hood) > Definición: Técnicas de primera generación basadas en reacciones de polimerización y detención mediante ddNTPs o degradación química para leer fragmentos individuales clonados. ### Segunda generación (NGS) - Fragmentación y amplificación masiva de DNA (emPCR o amplificación en puente) - Secuenciación masiva paralela (ej. Roche 454, Illumina, Ion Torrent) ### Tercera generación - Secuenciación de molécula única en tiempo real (SMRT, PacBio) y nanopore (Oxford Nanopore) - No requieren amplificación previa ## Principio básico de la polimerización in vitro - Una polimerasa incorpora dNTPs complementarios a la hebra molde y extiende un cebador. - Si se incorpora un ddNTP (carece de grupo 3'-OH) la síntesis se detiene. > Definición: ddNTP: didesoxinucleótido que, al incorporarse, termina la extensión de la cadena porque falta el grupo 3'-OH. ## Método Sanger: secuenciación por terminación (resumen) 1. Reacción con la hebra molde, un cebador, polimerasa y los 4 dNTPs. 2. Adición en baja proporción de un ddNTP marcado provoca terminaciones en distintas longitudes. 3. Separación por electroforesis y lectura del patrón (cromatograma). - Lectura manual: ~300 pb por muestra - Lectura automatizada (capilares): ~600–800 pb por muestra Fun fact: ¿Sabías que el proyecto del Genoma Humano combinó técnicas Sanger automatizadas con recursos informáticos para ensamblar cerca de 3 gigabases en menos de una década? ## Estrategias para secuenciar un genoma completo ### Método ordenado (jerárquico) 1. Fragmentar genoma en fragmentos grandes, clonar en BACs. 2. Ordenar BACs mediante mapas y marcadores. 3. Subclonar fragmentos y secuenciar. 4. Ensamblar contiguos grandes. ### Método aleatorio (shotgun) 1. Fragmentación aleatoria en piezas pequeñas. 2. Secuenciación masiva de fragmentos. 3. Ensamblaje por solapamiento de lecturas y contigs. > Definición: Cobertura (coverage) es el número medio de veces que aparece cada base en las lecturas; fórmula: $$\text{Cobertura} = \frac{N \times L}{G}$$ donde $N$ es número de lecturas, $L$ longitud media de lecturas y $G$ longitud del genoma. Ejemplo: Para H. influenzae con $N=24304$, $L=480$ y $G=1\,830\,000$ se obtiene cobertura aproximada $$\frac{24304 \times 480}{1\,830\,000} = 6.4\times$$ - Recomendación práctica: cobertura mínima de $6\times$–$10\times$ para ensamblajes razonables. ## Ensamblaje de lecturas - Lectura: secuencia parcial obtenida en una reacción. - Ensamblaje por solapamiento: unir lecturas que comparten regiones idénticas para formar contigs. - Parejas de extremos apareados (paired-ends) ayudan a resolver repeticiones y ordenar contigs en scaffolds. > Definición: Scaffold (supercontiguo) es un conjunto de contigs con posiciones relativas conocidas, pero con huecos de longitud desconocida entre ellos. ## Mapa