Resumen de PCR y Electroforesis en Gel: Fundamentos y Aplicaciones

## Introducción La electroforesis en gel es una técnica de laboratorio que permite separar moléculas cargadas, como fragmentos de ADN, en función de su tamaño al aplicar un campo eléctrico a través de una matriz porosa (gel). Este documento explica los principios básicos, el equipo necesario, el protocolo general, la interpretación de resultados y aplicaciones prácticas para estudiantes que no asisten a prácticas presenciales. > Definición: La electroforesis es una técnica de separación de moléculas cargadas mediante su migración a través de una matriz porosa bajo la influencia de un campo eléctrico. ## Principios básicos ### Factores que afectan la migración - **Carga**: En condiciones habituales de tampón (pH alcalino), los fragmentos de ADN tienen carga neta negativa por los grupos fosfato; por tanto migran hacia el ánodo (polo positivo). - **Tamaño**: En geles de agarosa la movilidad es inversamente proporcional al tamaño del fragmento; fragmentos pequeños avanzan más que fragmentos grandes. - **Forma**: Para proteínas u otras moléculas la con-formación influye; para ADN de cadena lineal simple la forma no es determinante en condiciones normales. - **Tamaño del poro del gel**: Determinado por la concentración de agarosa; a mayor % de agarosa, menor diámetro de poro y menor movilidad de los fragmentos. > Definición: El tampón (por ejemplo, TBE o TAE) mantiene el pH y la conductividad del medio para asegurar una migración constante. ### Condiciones experimentales controladas El investigador controla el pH y el uso de agentes desnaturalizantes (cuando procede) para que la migración dependa principalmente del **tamaño**. Para proteínas se suele usar SDS para uniformar carga y forma; para ADN/ARN no es necesario porque carecen de estructura terciaria significativa. ## Materiales y equipo - **Cubeta**: recipiente donde se sitúa el gel y el tampón; alberga los electrodos. - **Soporte electroforético**: el gel (agarosa para ADN) donde se forman los pocillos para cargar muestras. - **Fuente de alimentación**: genera la diferencia de potencial entre ánodo y cátodo. - **Peine**: para crear los pocillos de carga. - **Tampón de electroforesis**: TBE 1X o TAE 1X. - **Tampón de carga (Simple Loading Buffer 3X)**: mezcla que añade densidad y colorante para visualizar la carga. - **Marcadores de peso molecular**: patrones de ADN con fragmentos de tamaño conocido. - **Colorantes**: bromuro de etidio, SYBR Safe, RedSafe, azul de bromofenol, etc. ## Preparación del gel de agarosa (protocolo básico) 1. Asegúrate de que la cubeta esté limpia y (cuando proceda) esterilizada. 2. Prepara el tampón (TBE 1X o TAE 1X). 3. Pesa la agarosa para obtener la concentración deseada (por ejemplo, $0.8\%$ a $2\%$). La concentración depende del rango de tamaños que quieras resolver. 4. Mezcla agarosa en polvo con el tampón y calienta hasta disolver (evitando ebullición fuerte). 5. Deja atemperar la solución y, si se desea, añade un tinción intercalante (bromuro de etidio) o un tinte seguro (SYBR Safe, RedSafe) según las normas del laboratorio. 6. Prepara la cubeta y coloca cinta termoestable en los extremos si es necesario; coloca el peine para formar los pocillos. 7. Vierte la agarosa en la cubeta evitando burbujas y espera a que solidifique. 8. Retira el peine con cuidado y coloca el gel en la cubeta con tampón hasta cubrirlo. > Definición: Concentración del gel: porcentaje en masa/volumen de agarosa usado para ajustar el tamaño de poro y la resolución de fragmentos. ## Preparación y carga de muestras - Mezcla la muestra de ADN con tampón de carga 3X en proporción aproximada $5:1$ (muestra:tampón 3X) para obtener una mezcla final adecuada. - Carga un carril con el marcador de peso molecular (patrón) como referencia. - Carga cada muestra en los pocillos asignados y anota la correspondencia de pocillo-muestra. - Programa la fuente de alimentación; un valor habitual es $\sim110\,$V, aunque puede ajustarse según tamaño del gel y objetivo de resolución.