Shrnutí na Instrumentální chromatografické techniky

## Kapalinová chromatografie (LC) — Úvod Kapalinová chromatografie je analytická technika pro separaci složek směsí na základě jejich rozdílných afinit k **stacionární fázi (SF)** a **mobilní fázi (MF)**. Tento materiál shrnuje klíčové principy, typy kolón, přístrojové části a detektory, s praktickými příklady a aplikacemi. > **Definice:** Kapalinová chromatografie je metoda, při které je směs rozpuštěná v mobilní fázi vedena přes kolonu obsahující stacionární fázi a jednotlivé složky se separují podle rozdílných interakcí se SF. ## Základní části LC přístroje 1. **Zásobník mobilní fáze (MF)** – roztoky vysoké čistoty (p.a., HPLC-grade). 2. **Pumpa** – dodává MF stabilním průtokem, obvyklé rozsahy $0{,}01$–$10\ \mathrm{ml/min}$. 3. **Autosampler / injektor** – vpraví přesné množství vzorku do proudu MF. 4. **Kolona (stacionární fáze, SF)** – klíčová pro separaci. 5. **Detektor** – typicky UV/VIS, fluorescenční, refraktometrický nebo elektrochemický. 6. **Výpočetní systém** – zpracování signálu, integrace píků a vyhodnocení výsledků. > **Definice:** Pumpa isokratická podává konstantní složení MF; pumpa pro gradientní eluci mění složení MF v čase. ## Stacionární fáze — typy a vlastnosti Kolony se liší podle konstrukce SF: ### Monolitické kolony - SF tvoří jednolitý pórovitý kus materiálu. - Výhody: nižší zpětný tlak, vyšší průtok, různé typy pórů (makro/mezopóry) pro lepší průtok a kapacitu. ### Náplňové kolony (partikulární) - Kovový obal kolony o délce typicky $3$–$20\ \mathrm{cm}$ plněný mikročásticemi SF. - Vysoká separační účinnost, ale i vysoký zpětný tlak (až > $40\ \mathrm{MPa}$). - Klasická HPLC: částice $>2\ \mu\mathrm{m}$; UHPLC: částice $<2\ \mu\mathrm{m}$. ### Chemické modifikace SF - SF může být modifikována chemickými skupinami: uhlovodíkové řetězce (C8, C18), aminy, amidy, atd. - Umožňuje cílenou selektivitu pro analytické aplikace. ## Chromatografické módy (dle SF) Tabulka shrnující hlavní módy: | Mód | Povaha SF | Typ mobilní fáze (příklady) | Aplikace | |---|---:|---|---| | Reverzní fáze (RP) | nepolární SF (např. C18) | polární MF (voda + organika jako ethanol/MeOH + kyselina) | nejběžnější; analýza malých organických molekul, farmaceutik | | Normální fáze (NP / HILIC) | polární SF | méně polární MF (acetonitril + voda) | separace velmi polárních sloučenin, sacharidů | | Iontově-výměnná | iontoměniče: kationy/aniony | vodné roztoky s iontovou silou | separace proteinů, peptidů, iontů | | Chirální chromatografie | SF s chirálními sítí | závisí na módu | separace enantiomerů (D/L) | > **Definice:** Reverzní fáze znamená nepolární stacionární fázi a polární mobilní fázi; je to nejčastěji používaný mód. ### Iontově-výměnná chromatografie - **Katexy** (kationměniče) obsahují kyselé skupiny, např. COOH. - **Anexy** (anionměniče) obsahují zásadité skupiny, např. NH2. - Při zvyšující se iontové síle mobilní fáze se vázané ionty postupně uvolňují podle síly iontové vazby. - Časté aplikace: separace bílkovin, peptidů, anorganických iontů. ## Parametry ovlivňující separaci - **Velikost částic SF:** menší částice zvyšují účinnost, ale i zpětný tlak. - **HETP (height equivalent to a theoretical plate)** – výškový ekvivalent teoretického patra; nižší HETP znamená vyšší účinnost kolony. > **Definice:** HETP je výška sloupce, která odpovídá jednomu teoretickému patru; používá se pro porovnání rozlišovací schopnosti kolony. ## Mobilní fáze (MF) - Směsi elučních rozpouštědel podle eluotropní řady a charakteru analyzovaných složek. - Musí být vysoce čisté (HPLC-grade), nízké viskozity a kompatibilní s detektorem a SF. - Režimy eluce: 1. **Isokratická eluce:** konstantní složení MF. 2. **Gradientní eluce:** postupné měnění složení MF (binární, ternární, kvarterní) pro lepší separaci komplexních směsí. ## Detektory používané v LC - **Optické detektory:** UV/VIS (nejčastější; diodové pole umožňuje více vlnových délek), infračervený, fluorescenční, refraktometrický. - **Elektrochemické detektory:** konduktometr (