Podcast na Instrumentální chromatografické techniky

Kapitoly

Úvod do molekulárního závodu

Princip separačního závodu

Cílová fotografie: Chromatogram

Příprava před startem: Vzorky

Moderní extrakční metody

Plošná chromatografie zblízka: TLC

Příprava a start závodu

Detekce a vyhodnocení

Chromatografie v oblacích

Horká vstupenka na kolonu

Závodní dráha pro molekuly

Kdo čeká v cíli?

Co nám říká výsledek?

Co je HPLC?

Srdce systému: Kolona

Různé módy separace

Jak to vidíme?

Nová dimenze chromatografie

Hrdina jménem CO2

Víc než jen oddělování

Nejcitlivější detektor

Jak to funguje?

Kvadrupól v akci

Ještě přesnější analýza

Shrnutí a rozloučení

Přepis

Lukáš: …počkat, takže celá ta věc je vlastně takový závod pro molekuly? To je neuvěřitelné.

Eliška: Přesně tak! A některé jsou sprinteři a jiné zase maratonci. Každá má jinou rychlost a jinou strategii, jak se dostat do cíle.

Lukáš: To je geniální přirovnání! A já myslím, že tohle si musí poslechnout každý. Posloucháte Studyfi Podcast a dnes se ponoříme právě do světa chromatografie.

Eliška: Přesně tak. Je to separační, tedy rozdělovací metoda, kde se směs látek neustále rozděluje mezi dvě fáze, které se spolu nemíchají.

Lukáš: Dobře, dvě fáze. Co si pod tím mám představit?

Eliška: Jedna je nepohyblivá, té říkáme stacionární fáze. A druhá je pohyblivá, to je mobilní fáze. Ta stacionární stojí na místě a mobilní přes ni nebo skrz ni proudí a unáší s sebou molekuly z naší směsi.

Lukáš: Takže se vracíme k tomu závodu. Stacionární fáze je jako závodní dráha a mobilní fáze je... třeba vítr, co tlačí závodníky dopředu?

Eliška: Skoro. Spíš jako řeka, která je unáší. A teď to nejdůležitější – ta dráha, stacionární fáze, může být pro některé molekuly víc „lepkavá“ než pro jiné. Většinou to souvisí s polaritou.

Lukáš: Aha, takže staré známé „podobné se rozpouští v podobném“?

Eliška: Přesně to. Pokud máme polární stacionární fázi, bude silněji zadržovat polární látky. Ty se jí budou držet jako o život. A nepolární mobilní fáze je pak bude jen tak lehce unášet.

Lukáš: Takže kdo vyhraje tenhle závod? Kdo bude v cíli první?

Eliška: V tomhle případě ty nejméně polární látky. Nejsou tak „přilepené“ k dráze, takže je mobilní fáze odnese nejdál a nejrychleji. Naopak ty nejvíce polární se budou loudat a do cíle dorazí jako poslední.

Lukáš: Chápu. Celé je to tedy o tom, jak dlouho která látka stráví na té stacionární fázi. To zní logicky.

Eliška: Přesně. Vědecky to popisuje takzvaná distribuční konstanta, což je v podstatě jen poměr, jak moc látka preferuje stacionární fázi oproti té mobilní.

Lukáš: Dobře, závod proběhl, molekuly jsou v cíli. Jak ale zjistíme, kdo kdy doběhl? Koukáme na to mikroskopem?

Eliška: To naštěstí nemusíme. Na konci té dráhy je detektor a ten nám vykreslí grafický výstup, kterému říkáme chromatogram.

Lukáš: Graf. To zní o dost jednodušeji. Co na něm vidím?

Eliška: Je to závislost signálu z detektoru na čase. Každá oddělená látka vytvoří na grafu takový kopeček, kterému říkáme pík. Čas, ve kterém se pík objeví, je retenční čas. To je kvalitativní údaj – říká nám, *co* je to za látku.

Lukáš: A poznám z toho i kolik té látky tam bylo?

Eliška: Ano! To je kvantitativní údaj. Ten zjistíme z plochy pod tím píkem, nebo z jeho výšky. Čím větší pík, tím víc látky.

Lukáš: Takže chromatogram je v podstatě taková cílová fotografie a výsledková listina dohromady. A existuje jen jeden typ takového závodu, nebo je jich víc?

Eliška: Těch disciplín je celá řada. Můžeme je dělit třeba podle toho, jak je uspořádaná stacionární fáze. Buď je to plošná chromatografie, třeba na tenké vrstvě, známá jako TLC, nebo kolonová, kde je stacionární fáze nacpaná v trubičce, tedy koloně.

Lukáš: A co ta mobilní fáze? Ta je vždycky kapalina?

Eliška: Právě že ne. Může to být kapalina, a pak mluvíme o kapalinové chromatografii (LC), nebo plyn, a to je potom plynová chromatografie (GC).

Lukáš: Dobře. Ale co když chci analyzovat třeba krev? To přece není jen čistá směs dvou látek. To je... no, docela nepořádek.

Eliška: Máš naprostou pravdu. Biologický materiál je hrozně složitá směs, plná proteinů, solí a všeho možného. Proto je naprosto klíčová příprava vzorku, než ho vůbec pustíme na startovní čáru.

Lukáš: Musíme ho nějak „vyčistit“?

Eliška: Přesně. Musíme odstranit látky, které by nám zničily kolonu, třeba proteiny, nebo které by rušily signál. K tomu slouží filtrace, centrifugace, ale hlavně různé typy extrakce.

Lukáš: Extrakce? To zní jako něco z kriminálky.

Eliška: Trochu. Nejčastější je extrakce na tuhou fázi, neboli SPE. Představ si malou kolonu se sorbentem, který specificky zachytí jen tu látku, která nás zajímá. Všechno ostatní propláchneme a vyhodíme. Pak naší látku uvolníme do čisté zkumavky.

Lukáš: A co ta druhá? Kapalina-kapalina?

Eliška: To je LLE. Tam využíváme dvě nemísitelné kapaliny, třeba vodu a olej. Nebo spíš vodu a hexan. Látku z vodného roztoku „vytřepeme“ do toho organického rozpouštědla. Je to klasika s dělící nálevkou, kterou zná každý chemik.

Lukáš: Tohle všechno zní jako spousta práce se zkumavkami a nálevkami. Neexistují nějaké modernější, rychlejší metody?

Eliška: Samozřejmě! Dnes se hodně používají mikroextrakční techniky. Šetří čas, rozpouštědla a stačí jim mnohem menší objem vzorku. Máme třeba SPME, mikroextrakci na tuhou fázi.

Lukáš: Co to je?

Eliška: Představ si speciální stříkačku, která má na konci tenké vlákno. To vlákno ponoříš do vzorku, látky se na něj nachytají, a pak ho jen přeneseš do analyzátoru. Je to elegantní a efektivní.

Lukáš: Jako takový molekulární rybářský prut!

Eliška: Přesně tak! A pak je tu třeba MEPS, kde je ten sorbent z klasické SPE miniaturizovaný přímo v jehle stříkačky. Je to extrémně rychlé a dá se to plně automatizovat.

Lukáš: Zmínila jsi na začátku tu plošnou chromatografii, TLC. Jak to funguje v praxi? To se ty molekuly prohánějí po nějaké destičce?

Eliška: V podstatě ano. Stacionární fáze je nanesená v tenké vrstvě, nejčastěji je to silikagel, na hliníkové nebo skleněné desce. Silikagel je porézní oxid křemičitý s obrovským povrchem. Ideální závodní dráha.

Lukáš: A co je tam ta mobilní fáze?

Eliška: To je nějaké rozpouštědlo nebo směs rozpouštědel. Na desku naneseme tečku našeho vzorku, postavíme ji do nádoby s trochou mobilní fáze na dně a ta pak vzlíná po desce nahoru a unáší s sebou složky vzorku.

Lukáš: A ty se po cestě rozdělí, protože každá je jinak „přilepená“ k tomu silikagelu.

Eliška: Přesně tak! Na konci uvidíš místo jedné startovní tečky několik skvrn v různých výškách. Každá skvrna je jedna oddělená látka. Je to rychlá, levná a velmi užitečná technika.

Lukáš: Páni. Takže chromatografie je vlastně neuvěřitelně mocný nástroj, jak udělat pořádek v molekulárním chaosu. Ať už na desce, nebo v koloně.

Eliška: Přesně jsi to vystihl. A to jsme dnes probrali jen základy. Příště se podíváme mnohem hlouběji na kolonovou chromatografii, kde se ty závody odehrávají pod vysokým tlakem a s neuvěřitelnou přesností.

Lukáš: Dobře, takže než se vrhneme na ty vysokotlaké závody, pojďme si krok po kroku projít tu tenkovrstvou chromatografii. Jak to celé probíhá v laboratoři?

Eliška: Jasně. Představ si destičku potaženou tenkou vrstvou třeba silikagelu. To je stacionární fáze. Uděláš si tužkou startovní čáru a na ni kápneš tečku vzorku.

Lukáš: Takže v laboratoři si vlastně kreslíme? To zní dobře.

Eliška: V podstatě ano! Pak destičku postavíš do nádoby, kde je na dně trocha mobilní fáze. Důležité je, aby hladina byla pod startovní čarou.

Lukáš: A ta kapalina pak začne vzlínat nahoru a unášet vzorek s sebou. Co ale když jsou ty oddělené látky bezbarvé? Jak je uvidím?

Eliška: Dobrá poznámka. Buď destičku prosvítíme UV světlem, nebo ji postříkáme speciálním činidlem, které skvrny zviditelní. Jako třeba ninhydrin na aminokyseliny.

Lukáš: A jak potom poznám, co je která látka?

Eliška: Jednoduše. Změříš vzdálenost skvrny od startu a vydělíš ji celkovou vzdáleností, kterou urazila mobilní fáze. Tomu se říká retenční faktor, neboli Rf.

Lukáš: Takže je to vlastně takový unikátní otisk prstu pro každou molekulu v tomhle systému.

Eliška: Přesně tak! Je to rychlá a levná metoda, jak třeba v toxikologii odhalit drogy nebo jen zkontrolovat čistotu produktu v chemii.

Lukáš: Fantastické. A co když potřebujeme ty látky nejen vidět, ale i posbírat a zvážit? K tomu už asi tahle destička stačit nebude.

Eliška: Přesně. A tím se dostáváme k sofistikovanějším metodám, jako je sloupcová chromatografie, na kterou se podíváme příště.

Lukáš: Minule jsi zmínila sloupcovou chromatografii, Eliško. Ale než se k ní dostaneme, slyšel jsem o něčem, co zní ještě víc high-tech. Plynová chromatografie? To jako posíláme vzorky potrubní poštou z plynu?

Eliška: Skoro! Je to neuvěřitelně výkonná metoda. A máš pravdu, základ je plyn. Místo kapaliny, která protéká stacionární fází, tady máme takzvanou mobilní fázi, což je inertní plyn.

Lukáš: Inertní... takže plyn, co si jen tak proudí a nedělá neplechu se vzorkem?

Eliška: Přesně. Nejčastěji se používá helium nebo dusík. Tenhle plyn prostě unáší odpařený vzorek celým systémem. Jeho jediný úkol je být nosičem.

Lukáš: Počkat, odpařený vzorek? Takže to funguje jen pro látky, které můžeme přeměnit na plyn?

Eliška: Přesně tak. Vzorek se vstříkne do takzvaného injektoru. To je vlastně super horká komora, která ho okamžitě odpaří. Představ si, že jeden mikrolitr kapaliny — to je malinká kapička — vytvoří skoro půl mililitru páry!

Lukáš: Páni. A co se děje s tou párou dál? Vletí všechna do systému?

Eliška: Jak kdy. Tady přichází na řadu chytré injektory, nejčastěji takzvané Split/Splitless. Když máš hodně koncentrovaný vzorek, použiješ "split" režim, který většinu páry odfoukne pryč a do kolony pošle jen malou část.

Lukáš: A "splitless" je pro případy, kdy chceme analyzovat každou molekulu, co máme?

Eliška: Přesně. Tam jde do kolony celý objem vzorku. Je to pro stopové analýzy, kdy je vzorku málo.

Lukáš: Dobře, takže máme páru unášenou plynem. Kam letí dál?

Eliška: Do chromatografické kolony. To je to opravdové srdce přístroje. Může to být buď tenoučká, několik desítek metrů dlouhá kapilára...

Lukáš: Jako takový skleněný vlas?

Eliška: Přesně! Nebo to může být kratší a tlustší náplňová kolona, která je nacpaná stacionární fází. Kapiláry mají úžasnou rozlišovací schopnost, zatímco ty náplňové pojmou víc vzorku.

Lukáš: Takže molekuly proběhnou touhle dlouhou dráhou a co je čeká na konci? Nějaký cílový rozhodčí?

Eliška: Přesně tak! A říkáme mu detektor. A tady je plynová chromatografie neuvěřitelně variabilní. Máme univerzální detektory jako TCD, které změří skoro všechno. Pak třeba plamenový ionizační detektor...

Lukáš: Plamenový? To zní drsně.

Eliška: To taky je! Vzorek na konci prostě spálí ve vodíkovém plameni a měří vzniklé ionty. Je to super citlivé pro organické látky, ale... je to destruktivní. Vzorek už nikdy neuvidíš.

Lukáš: Takže je to takový detektiv, co po vyšetřování spálí všechny důkazy?

Eliška: Přesně tak! A pak máme moderní hmotnostní spektrometry, které jsou jako super-detektivové. Dokážou každou molekulu zvážit a přesně identifikovat.

Lukáš: Super. A co z toho všeho vyleze? Nějaký graf?

Eliška: Ano, chromatogram. Je to graf, kde vidíš takzvané píky. Klíčové jsou dvě věci. Zaprvé, čas, kdy se pík objeví — to je retenční čas. Ten ti říká, *o jakou látku* se jedná. Každá má svůj specifický čas.

Lukáš: Takže podle stopek poznáme závodníka. A co jeho výkon?

Eliška: To nám řekne výška nebo plocha toho píku. Čím je pík větší, tím víc dané látky ve vzorku bylo. Takže čas nám říká "kdo" to je, a výška nám říká "kolik" ho tam je. Je to jednoduché, ale geniální.

Lukáš: Fantastické. Kvalita i kvantita v jednom grafu. A co když ty látky nejsou těkavé a nejdou odpařit? To asi plynová chromatografie nezvládne, co?

Eliška: Přesně. A na to tady máme metody, kde mobilní fází není plyn, ale kapalina. Ale o tom si povíme zase příště.

Lukáš: Takže minule plyn, dneska kapalina. Jak se tedy liší kapalinová chromatografie? Předpokládám, že princip je stejný, jen místo 'letících' molekul teď máme 'plavající'?

Eliška: Přesně tak! Krásně řečeno. Téhle metodě říkáme vysokoúčinná kapalinová chromatografie, neboli HPLC. A ten název nelže… je to fakt výkonné. Skládá se to z pár základních částí: zásobník s kapalinou, pumpa, která ji tlačí, a pak samozřejmě kolona a detektor.

Lukáš: Počkat, proč potřebujeme pumpu a vysoký tlak? U plynu to taková síla nebyla.

Eliška: To je skvělá otázka. Je to proto, že ta kapalina se musí protlačit přes kolonu, která je doslova nacpaná miniaturními, hustými částicemi. A právě tyhle částice dělají tu magii separace.

Lukáš: Takže kolona je opět to nejdůležitější. Co přesně je uvnitř?

Eliška: Je to krátká kovová trubička plná mikročástic, nejčastěji na bázi silikagelu. A tady platí jednoduché pravidlo: čím menší částice, tím lepší rozdělení, ale taky tím vyšší tlak pumpa potřebuje. Tím se liší klasická HPLC od té ultra-vysokoúčinné, UHPLC, která používá částice menší než dva mikrometry.

Lukáš: Aha! Takže menší částice se rovnají ostřejším a lépe odděleným píkům v grafu.

Eliška: Bingo! A co je na tom nejlepší — podle toho, jakou stacionární a mobilní fázi zvolíme, můžeme látky dělit různými způsoby.

Lukáš: Takže si můžu vybrat, podle jaké vlastnosti se budou molekuly 'předbíhat'?

Eliška: Dá se to tak říct. Nejčastější je takzvaná reverzní fáze. Tam je stacionární fáze nepolární — třeba ten silikagel s navázanými uhlovodíky — a mobilní fáze je naopak polární, třeba směs vody a ethanolu.

Lukáš: Reverzní? Proč ne 'normální'?

Eliška: Protože 'normální' fáze, ta původní, byla přesně naopak. Ale reverzní je dnes mnohem univerzálnější. Ale tím to nekončí! Máme i iontově-výměnnou chromatografii pro bílkoviny nebo dokonce chirální, která umí oddělit zrcadlové obrazy molekul!

Lukáš: To zní jako sci-fi! Oddělit od sebe dvě prakticky identické molekuly…

Eliška: Je to tak. A když už máme látky krásně oddělené, musíme je nějak vidět.

Lukáš: Předpokládám, že tady máme víc možností na výběr než u plynové chromatografie?

Eliška: Rozhodně. Nejpopulárnější je UV/VIS detektor, který měří, kolik světla vzorek pohltil. Ale možností je spousta — fluorescenční, elektrochemické... skoro pro každou látku najdeme vhodný detektor, takže jsme velmi flexibilní.

Lukáš: Fantastické. Takže už víme, jak látky oddělit. Ale co když chci vědět nejen 'co' to je a 'kolik' toho je, ale potřebuju stoprocentní jistotu, o jakou molekulu jde?

Eliška: Výborný postřeh. A na to právě slouží spojení chromatografie s další, neuvěřitelně silnou technikou. Ale o tom si povíme zase příště.

Lukáš: Tak jo, Eliško, minule jsi nás pěkně napínala. Jakou neuvěřitelně silnou technikou tedy můžeme chromatografii vylepšit?

Eliška: Tou technikou je superkritická fluidní chromatografie, zkráceně SCFC. Zní to složitě, ale je to geniální.

Lukáš: Superkritická? To zní jako něco ze sci-fi filmu.

Eliška: Trochu jo. Jde o to, že jako mobilní fázi nepoužíváme kapalinu ani plyn, ale něco mezi tím — superkritickou tekutinu.

Lukáš: A co to přesně je?

Eliška: Představ si oxid uhličitý. Když ho zahřeješ nad 31 stupňů a stlačíš na víc než 73 atmosfér, dostane se do stavu, kde má vlastnosti plynu i kapaliny. Je hustý jako kapalina, ale má nízkou viskozitu jako plyn.

Lukáš: Takže se v koloně pohybuje super rychle a efektivně?

Eliška: Přesně tak! A proto je CO2 takový hrdina. Je levný, netoxický, nehořlavý a po analýze se prostě odpaří. Naprosto ekologické.

Lukáš: To je skvělé! Takže žádný nebezpečný odpad.

Eliška: Žádný. A tenhle princip se nepoužívá jen v analytice. Superkritický CO2 se používá i k extrakci látek, třeba k výrobě přírodních extraktů pro kosmetiku nebo léky.

Lukáš: Aha! Takže to je ta šetrná metoda, o které se mluví u bylinných doplňků?

Eliška: Přesně ta. Ale pojďme se teď podívat na tu nejdůležitější kombinaci, kterou jsem naznačila minule.

Lukáš: Tak jo, Eliško, jsem napnutý. Co je ta nejdůležitější kombinace?

Eliška: Je to spojení chromatografu s hmotnostním spektrometrem! Zkráceně MS. Je to ten nejcitlivější a nejselektivnější detektor, jaký si umíš představit.

Lukáš: Citlivější než ty předchozí? O kolik?

Eliška: Nepředstavitelně. Jsme schopni detekovat až pikogramy látky. To je biliontina gramu!

Lukáš: Páni. A jak to dělá? Jaký je princip?

Eliška: Zjednodušeně řečeno, je to taková váha na molekuly. Nejprve musíme molekuly přeměnit na nabité ionty. To se děje v ionizačním zdroji, třeba pomocí proudu elektronů.

Lukáš: Takže je „nabijeme“, aby reagovaly?

Eliška: Přesně tak. Tyhle nové ionty pak pošleme do hmotnostního analyzátoru, který je rozdělí podle jejich hmotnosti a náboje.

Lukáš: A ten analyzátor... to je ta nejdůležitější část?

Eliška: Ano, jedním z nejčastějších je kvadrupól. Představ si čtyři kovové tyče. Změnou napětí na nich vytvoříme pole, které propustí jen ionty o jedné konkrétní hmotnosti.

Lukáš: Takže je to jako vyhazovač v klubu, který pouští jen hosty ze seznamu?

Eliška: Přesně tak! Ostatní narazí do tyčí a nejsou detekovány. Jen ten vybraný ion proletí až k detektoru.

Lukáš: A dá se to ještě vylepšit?

Eliška: Jasně! Můžeme zapojit tři kvadrupóly za sebe. Tomu se říká trojitý kvadrupól neboli QqQ.

Lukáš: Tři vyhazovači? To už musí být extra exkluzivní klub.

Eliška: V podstatě ano. První vybere „rodičovský“ iont. Druhý ho rozbije na menší kousky – fragmenty. A třetí pak analyzuje tyhle konkrétní úlomky.

Lukáš: Aha! Takže dostaneme mnohem podrobnější „občanku“ té molekuly.

Eliška: Přesně. Je to neuvěřitelně přesné, ale má to jednu nevýhodu. Je to destruktivní detektor, takže vzorek se při analýze zničí.

Lukáš: Takže abychom to shrnuli. Nejdřív látky rozdělíme pomocí chromatografie a pak je pošleme do hmotnostního spektrometru, který nám řekne, co přesně to je.

Eliška: Přesně tak! Spojením těchto dvou technik získáme neuvěřitelně mocný nástroj pro analýzu prakticky čehokoliv.

Lukáš: Děkujeme, že jste s námi dnes byli. Bylo to fascinující.

Eliška: Já taky děkuju. A těším se zase příště u Studyfi Podcastu. Na slyšenou!