Zhrnutie na Laboratórne metódy vo veterinárnej imunológii

Laboratórne Metódy vo Veterinárnej Imunológii: Kompletný Rozbor

ZhrnutieTest znalostíKartičkyPodcastMyšlienková mapa

Úvod

Hematológia sa zaoberá štúdiom krvi, jej buniek a funkcií. Tento materiál predstavuje praktické laboratórne techniky používané pri stanovení počtu leukocytov, farbení krvného náteru podľa Pappenheima a kontrole životnosti buniek pomocou trypanovej modrej. Obsah je upravený a zjednodušený pre samostatné štúdium.

Definícia: Hematológia je odbor medicíny a biológie, ktorý skúma krv, krvotvorné orgány a poruchy krvi.

Obsah a prehľad

  • Stanovenie počtu leukocytov (počet bielych krviniek)
  • Farbenie podľa Pappenheima (diferenciácia leukocytov v nátere)
  • Kontrola životnosti buniek (trypanová modrá)

1. Stanovenie počtu leukocytov

Pomôcky a materiál

  • Mikroskop
  • Vzorka nezráženej krvi s antikoagulantom (EDTA, heparín alebo citrát sodný)
  • Túrkov roztok (rozruší erytrocyty, zafarbí jadrá leukocytov)
  • Búrkerova komôrka
  • Eppendorfová skúmavka
  • Automatická mikropipeta (200 µl) so špičkami

Definícia: Túrkov roztok obsahuje ľadovú kyselinu octovú, ktorá lysuje erytrocyty a trombocyty, a metylovú violeť, ktorá zafarbuje jadrá leukocytov.

Postup krok za krokom

  1. Pripravíme riedenie: zmiešame $475\ \mu$l Túrkovho roztoku s $25\ \mu$l krvi (riedenie 1:20). Špičku prepláchneme v skúmavke.
  2. Náplav opatrne nanesieme do počítacieho priestoru Búrkerovej komôrky bez bublín.
  3. Po ustálení počítame leukocyty pri $200$-násobnom zväčšení v stredných štvorcoch mriežky.
  4. Odpočítame leukocyty v $50$ stredne veľkých štvorcoch (objem týchto 50 štvorcov je $0{,}2\ \mu$l).
  5. Prepočet: počet v $50$ štvorcoch vynásobíme $100$ (zohľadnenie riedenia 1:20 a prepočet na $1\ \mu$l). Príklad: ak v 50 štvorcoch napočítame $62$, výsledok je $62\times 100 = 6200$ leukocytov v $1\ \mu$l, t.j. $6{,}2\times 10^{6}/\mathrm{ml}$.

Tipy pri počítaní

  • Použiť uhlopriečny alebo priečny postup pre rozloženie počítania.
  • Po skončení očistiť komôrku a krycie sklíčko destilovanou vodou.
💡 Vedeli ste?Did you know that počítanie v 50 stredných štvorcoch zodpovedá objemu $0{,}2\ \mu$l, preto výsledný súčet vynásobíme $100$ pre získanie hodnoty v $1\ \mu$l?

Interpretácia výsledkov (praktické aplikácie)

  • Normálny počet leukocytov sa líši podľa druhu zvieraťa (pozri špecifické tabuľky v literatúre).
  • Neutropénia: neutrofily pod $1500/\mu$l, ťažká neutropénia < $500/\mu$l — zvýšené riziko bakteriálnych infekcií.
  • Neutrofília: zvýšený počet pri akútnych bakteriálnych infekciách, zápaloch, niektorých malignitách.
  • Eozinofília: môže indikovať parazitárnu infekciu alebo alergiu.

2. Farbenie podľa Pappenheima (May-Grünwald + Giemsa)

Účel

Kontrastné farbenie krvného náteru na rozlíšenie subpopulácií leukocytov a hodnotenie morfológie buniek.

Materiál

  • Mikroskop s imerzným objektívom (100x + olej)
  • Vzorka nezráženej krvi
  • Čisté podložné sklíčka
  • Automatická mikropipeta (200 µl)
  • May-Grünwaldov roztok
  • Roztok Giemsa-Romanovského (riešenie 1:10)

Definícia: Farbenie podľa Pappenheima kombinuje May-Grünwaldovo farbenie a Giemsa roztok na dosiahnutie kvalitnej diferenciácie leukocytov.

Príprava a náter

  1. Na podložné sklíčko nanesieme malú kvapku krvi ($\sim 20\ \mu$l).
  2. Druhé sklíčko priložíme pod uhlom $30^{\circ}$–$40^{\circ}$ pred kvapku a pohybom rozotrieme krv po celej dĺžke hrany, aby vznikol tenký, rovnomerný náter končiaci „do stratena“ približne $1$–$2\ \mathrm{cm}$ pred koncom sklíčka.
  3. Necháme náter dobre zaschnúť na vzduchu.

Postup farbenia

  1. Vložíme sklíčko do nádoby s May-Grünwaldovým roztokom a farbíme $5$ minút.
  2. Prenesieme do May-Grünwaldu zriedeného $1:1$ s neutrálne destilovanou vodou, farbíme $1$ minútu.
  3. Opláchneme sklíčko neutrálne vodou.
  4. Ponoríme do Giemsa-Romanovského roztoku zriedeného $1:10$ a farbíme $10$–$15$ minút.
  5. Opláchneme pod tečúcou vodou, vysušíme a hodnotíme pod mikroskopom s olejom pri $100$x.

Hodnotenie farbenia (znaky správneho farbenia)

  • Dobre zafarbený náter: ružovofialový až modrofialový odtieň.
  • Neutrofily: svetlá cytoplazma, tmavomodré jadro.
  • Eozinofilné granu
Zaregistruj sa pre celé zhrnutie
KartičkyTest znalostíZhrnutiePodcastMyšlienková mapa
Začni zadarmo

Už máš účet? Prihlásiť sa

Hematológia – základné techniky

Klíčová slova: Imunológia, Hematológia

Klíčové pojmy: Túrkov roztok lysuje erytrocyty a zafarbí jadrá leukocytov, Riedenie pri počítaní leukocytov: 1:20 (475 µl Túrkov : 25 µl krvi), Počítať leukocyty v 50 stredných štvorcoch (objem 0,2 µl) a vynásobiť 100 pre 1 µl, Pri farbení Pappenheim: May-Grünwald 5 min, riedený 1:1 1 min, Giemsa 1:10 10–15 min, Správny náter: tenký, rovnomerný, končí „do stratena" 1–2 cm pred koncom sklíčka, Trypanová modrá 0,5% farbí iba mŕtve bunky; mix 1:1 s bunkovou suspenziou (25 µl + 25 µl), Pri hodnotení viablity počítame zvyčajne 100 buniek a uvádzame % mŕtvych/živých, Eozinofilné granuly majú pri správnom farbení tehlovočervenú farbu, pH vody pri oplachu ovplyvňuje výsledné zafarbenie náteru, Vzorky na funkčné testy treba vyšetriť čo najskôr po odbere

## Úvod Hematológia sa zaoberá štúdiom krvi, jej buniek a funkcií. Tento materiál predstavuje praktické laboratórne techniky používané pri stanovení počtu leukocytov, farbení krvného náteru podľa Pappenheima a kontrole životnosti buniek pomocou trypanovej modrej. Obsah je upravený a zjednodušený pre samostatné štúdium. > Definícia: Hematológia je odbor medicíny a biológie, ktorý skúma krv, krvotvorné orgány a poruchy krvi. ## Obsah a prehľad - Stanovenie počtu leukocytov (počet bielych krviniek) - Farbenie podľa Pappenheima (diferenciácia leukocytov v nátere) - Kontrola životnosti buniek (trypanová modrá) ## 1. Stanovenie počtu leukocytov ### Pomôcky a materiál - Mikroskop - Vzorka nezráženej krvi s antikoagulantom (EDTA, heparín alebo citrát sodný) - Túrkov roztok (rozruší erytrocyty, zafarbí jadrá leukocytov) - Búrkerova komôrka - Eppendorfová skúmavka - Automatická mikropipeta (200 µl) so špičkami > Definícia: Túrkov roztok obsahuje ľadovú kyselinu octovú, ktorá lysuje erytrocyty a trombocyty, a metylovú violeť, ktorá zafarbuje jadrá leukocytov. ### Postup krok za krokom 1. Pripravíme riedenie: zmiešame $475\ \mu$l Túrkovho roztoku s $25\ \mu$l krvi (riedenie 1:20). Špičku prepláchneme v skúmavke. 2. Náplav opatrne nanesieme do počítacieho priestoru Búrkerovej komôrky bez bublín. 3. Po ustálení počítame leukocyty pri $200$-násobnom zväčšení v stredných štvorcoch mriežky. 4. Odpočítame leukocyty v $50$ stredne veľkých štvorcoch (objem týchto 50 štvorcov je $0{,}2\ \mu$l). 5. Prepočet: počet v $50$ štvorcoch vynásobíme $100$ (zohľadnenie riedenia 1:20 a prepočet na $1\ \mu$l). Príklad: ak v 50 štvorcoch napočítame $62$, výsledok je $62\times 100 = 6200$ leukocytov v $1\ \mu$l, t.j. $6{,}2\times 10^{6}/\mathrm{ml}$. ### Tipy pri počítaní - Použiť uhlopriečny alebo priečny postup pre rozloženie počítania. - Po skončení očistiť komôrku a krycie sklíčko destilovanou vodou. Did you know that počítanie v 50 stredných štvorcoch zodpovedá objemu $0{,}2\ \mu$l, preto výsledný súčet vynásobíme $100$ pre získanie hodnoty v $1\ \mu$l? ### Interpretácia výsledkov (praktické aplikácie) - Normálny počet leukocytov sa líši podľa druhu zvieraťa (pozri špecifické tabuľky v literatúre). - Neutropénia: neutrofily pod $1500/\mu$l, ťažká neutropénia < $500/\mu$l — zvýšené riziko bakteriálnych infekcií. - Neutrofília: zvýšený počet pri akútnych bakteriálnych infekciách, zápaloch, niektorých malignitách. - Eozinofília: môže indikovať parazitárnu infekciu alebo alergiu. ## 2. Farbenie podľa Pappenheima (May-Grünwald + Giemsa) ### Účel Kontrastné farbenie krvného náteru na rozlíšenie subpopulácií leukocytov a hodnotenie morfológie buniek. ### Materiál - Mikroskop s imerzným objektívom (100x + olej) - Vzorka nezráženej krvi - Čisté podložné sklíčka - Automatická mikropipeta (200 µl) - May-Grünwaldov roztok - Roztok Giemsa-Romanovského (riešenie 1:10) > Definícia: Farbenie podľa Pappenheima kombinuje May-Grünwaldovo farbenie a Giemsa roztok na dosiahnutie kvalitnej diferenciácie leukocytov. ### Príprava a náter 1. Na podložné sklíčko nanesieme malú kvapku krvi ($\sim 20\ \mu$l). 2. Druhé sklíčko priložíme pod uhlom $30^{\circ}$–$40^{\circ}$ pred kvapku a pohybom rozotrieme krv po celej dĺžke hrany, aby vznikol tenký, rovnomerný náter končiaci „do stratena“ približne $1$–$2\ \mathrm{cm}$ pred koncom sklíčka. 3. Necháme náter dobre zaschnúť na vzduchu. ### Postup farbenia 1. Vložíme sklíčko do nádoby s May-Grünwaldovým roztokom a farbíme $5$ minút. 2. Prenesieme do May-Grünwaldu zriedeného $1:1$ s neutrálne destilovanou vodou, farbíme $1$ minútu. 3. Opláchneme sklíčko neutrálne vodou. 4. Ponoríme do Giemsa-Romanovského roztoku zriedeného $1:10$ a farbíme $10$–$15$ minút. 5. Opláchneme pod tečúcou vodou, vysušíme a hodnotíme pod mikroskopom s olejom pri $100$x. ### Hodnotenie farbenia (znaky správneho farbenia) - Dobre zafarbený náter: ružovofialový až modrofialový odtieň. - Neutrofily: svetlá cytoplazma, tmavomodré jadro. - Eozinofilné granu