Podcast o Laboratórne metódy vo veterinárnej imunológii

Kapitoly

Úvod do bunkovej imunity

Dve hlavné rodiny bielych krviniek

Ako ich rozoznáme pod mikroskopom?

Úlohy jednotlivých hráčov

Čo nám prezradí krvný obraz?

Farbenie podľa Pappenheima

Živé verzus mŕtve bunky

Dúha v krvi: Pappenheimovo farbenie

Umenie krvného náteru

Magický proces farbenia

Čo nám čísla hovoria?

Zhrnutie a záver

Přepis

Tomáš: Väčšina ľudí si myslí, že všetky biele krvinky sú v podstate rovnaké – takí malí vojaci, ktorí bojujú s infekciou. Ale v skutočnosti je to skôr ako špeciálna jednotka, kde každý člen má úplne inú, superšpecializovanú úlohu.

Nina: Presne tak, Tomáš! To je skvelé prirovnanie. Nie je to len jedna armáda, je to celé spektrum špecialistov. A práve o tom sa dnes budeme rozprávať v Studyfi Podcast.

Tomáš: Super! Takže dnes sa ponoríme do sveta bunkovej imunity. Nina, kde vlastne tieto bunky sú? Lietajú si len tak v krvi?

Nina: Dobrá otázka. Niektoré áno, tie poznáme ako leukocyty alebo biele krvinky, a tie cirkulujú v krvnom obehu. Ale mnohé ďalšie sa nachádzajú priamo v tkanivách a orgánoch, kde číhajú na problémy. Sú to takí strážcovia na svojich postoch, napríklad mastocyty, makrofágy a dendritové bunky.

Tomáš: Takže máme hliadky v krvi a strážcov v tkanivách. To znie organizovane. Odkiaľ sa všetky tieto rôzne bunky berú?

Nina: Všetky pochádzajú z jedného spoločného predka. Predstav si to ako kmeň stromu. Tým kmeňom sú takzvané pluripotentné hematopoetické kmeňové bunky, skrátene HSC. Z nich sa potom vyvíjajú a diferencujú všetky ostatné.

Tomáš: Kmeňové bunky... to je ako taká super-bunka, ktorá sa môže stať čímkoľvek, však? Na aké hlavné „vetvy“ sa delí?

Nina: Presne. Delia sa na dve základné skupiny, alebo ak chceš, dve veľké rodiny. Prvá je myeloidná bunková línia. To sú takí prví respondenti, ktorí zasahujú okamžite. Patria sem neutrofily, eozinofily, bazofily a monocyty.

Tomáš: Myeloidná línia... znie to ako niečo z komiksu. A tá druhá rodina?

Nina: Tá druhá je lymfoidná bunková línia. To sú naši špecialisti na dlhodobé misie a pamäť. Sem patria známe T-lymfocyty, B-lymfocyty a potom ešte NK-bunky, čo sú takí prirodzení zabijaci.

Tomáš: T- a B-lymfocyty, o tých som počul. To sú tí, čo si pamätajú infekcie a vytvárajú protilátky, správne?

Nina: Presne tak! Oni sú súčasťou špecifickej, získanej imunity. Kým myeloidné bunky reagujú na všetko cudzie všeobecne, lymfocyty sa učia rozpoznávať konkrétnych nepriateľov a pamätajú si ich na budúce.

Tomáš: Dobre, takže máme rôzne typy buniek s rôznymi úlohami. Ale ako ich vedci dokážu od seba rozoznať? Vyzerajú všetky rovnako?

Nina: Vôbec nie, a to je na tom to fascinujúce. Rozdeľujeme ich podľa toho, ako vyzerá ich jadro a či majú v cytoplazme malé zrniečka, teda granuly. Jedna skupina sú granulocyty.

Tomáš: Granulocyty... takže tie majú granuly. Logické.

Nina: Áno. Konkrétne polymorfonukleárne granulocyty. Majú segmentované jadro, ktoré vyzerá ako pospájané z viacerých častí, a vnútri majú tie granuly, ktoré sa rôzne farbia. Sem patria neutrofily, eozinofily a bazofily.

Tomáš: A tí druhí sú teda bez granúl?

Nina: Presne. To sú mononukleárne agranulocyty. „A-granulo“ znamená bez granúl. A „mono-nukleárne“ znamená, že majú jedno, celistvé jadro. Sem patria lymfocyty, ktoré majú veľké, takmer dokonale okrúhle jadro, a monocyty, ktorých jadro má taký typický tvar obličky alebo fazule.

Tomáš: Tak si to zhrňme. Máme tu neutrofily, eozinofily, bazofily, monocyty a lymfocyty. Čo presne robia? Začnime s tými monocytmi s obličkovým jadrom.

Nina: Jasné. Monocyty sú zaujímavé, lebo keď opustia krvné riečisko a prejdú do tkanív, zmenia sa. Diferencujú sa buď na makrofágy, čo sú v podstate „veľkí jedáci“, alebo na dendritové bunky, ktoré sú akoby informátori imunitného systému.

Tomáš: Takže monocyt je taký chameleón. A čo robia tí „veľkí jedáci“?

Nina: Ich hlavnou úlohou, spolu s granulocytmi, je fagocytóza. To je kľúčový mechanizmus vrodenej, nešpecifickej imunity. V podstate doslova pohltia a strávia cudzorodé častice, napríklad baktérie. Predstav si Pac-Mana, ako papá guľôčky.

Tomáš: To je skvelé prirovnanie! Takže fagocytóza je upratovanie neporiadku. A preto sa základné testy imunity zameriavajú práve na toto?

Nina: Presne. Základné in vitro testy vrodenej imunity často testujú práve schopnosť fagocytózy. Sú pomerne jednoduché na prípravu, aj keď vyhodnotenie môže byť zložitejšie. T- a B-lymfocyty, teda špecifická imunita, sa testujú oveľa komplikovanejšie, preto sa to v bežnej praxi, napríklad vo veterinárnej medicíne, robí skôr na výskumnej úrovni.

Tomáš: Ale nejaké testy špecifickej imunity sa predsa len používajú, nie? Spomínali sa kožné testy.

Nina: Áno, in vivo testy, teda testy priamo na organizme, sú bežné. Napríklad kožné testy na alergie, ktoré hodnotia hypersenzitívne reakcie. Alebo známy tuberkulínový test, ktorý sa používa na odhalenie tuberkulózy u zvierat. Tie sú v praxi veľmi užitočné.

Tomáš: Dobre, poďme k praxi. Čo znamená, keď mi lekár povie, že mám zvýšený alebo znížený počet nejakých bielych krviniek?

Nina: Skvelá otázka, pretože práve tieto počty nám dávajú dôležité stopy o tom, čo sa v tele deje. Napríklad monocytóza, teda zvýšený počet monocytov, sa môže objaviť pri niektorých vírusových a bakteriálnych infekciách, ako je tuberkulóza, ale aj pri autoimunitných ochoreniach.

Tomáš: A čo lymfocyty? Keď mám veľa lymfocytov, znamená to, že moje telo bojuje s vírusom?

Nina: Často áno. Zvýšený počet lymfocytov, lymfocytóza, je typická po akútnej vírusovej infekcii. Naopak, nízky počet, lymfocytopénia, môže byť znepokojujúci. Môže to byť spôsobené napríklad užívaním kortikosteroidov, intenzívnou záťažou, ale aj chemoterapiou alebo vážnejšími ochoreniami ako leukémia.

Tomáš: Wow. Takže jednoduché počítanie buniek vie odhaliť naozaj veľa. Je to ako detektívna práca.

Nina: Absolútne. Každá odchýlka od normálu je pre nás dôležitý signál, ktorý musíme správne interpretovať.

Tomáš: Spomínala si, že bunky vyzerajú pod mikroskopom rôzne. Ako dosiahneme, aby sme ich tak pekne farebne videli a vedeli odlíšiť? Veď normálne sú asi priesvitné, nie?

Nina: Presne tak, sú takmer neviditeľné. Preto používame špeciálne farbiace techniky. Jedna z najbežnejších metód sa volá farbenie podľa Pappenheima. Je to kombinovaná metóda, ktorá využíva dve farbivá.

Tomáš: A čo to spraví? Každá bunka sa zafarbí inak?

Nina: V podstate áno. Rôzne časti bunky – jadro, cytoplazma, granuly – reagujú s farbivami odlišne. Vďaka tomu vieme jednotlivé typy leukocytov krásne rozlíšiť. Napríklad neutrofily majú svoje typické segmentované jadro a jemné, slabo sa farbiace granuly.

Tomáš: A tie ostatné?

Nina: Eozinofily majú tiež segmentované jadro, ale ich granuly sú veľké a farbia sa na sýto červeno alebo oranžovo. Preto sa volajú „eozino-filné“, lebo milujú farbivo eozín. Bazofily majú zase veľké, tmavomodré až fialové granuly, ktoré často úplne prekryjú jadro.

Tomáš: A čo tí naši agranulocyty? Tí sú asi menej farební.

Nina: Sú inak farební. Lymfocyt má obrovské, tmavofialové, takmer okrúhle jadro a len veľmi tenký lem svetlomodrej cytoplazmy okolo neho. A monocyt má to svoje typické obličkovité, svetlejšie fialové jadro a viac takej sivo-modrej cytoplazmy.

Tomáš: Takže farbenie je kľúčové. Bez neho by sme vlastne len hádali. Je úžasné, ako takýto jednoduchý trik odhalí celú komplexnosť imunitného systému.

Nina: Presne tak. Je to základná, ale nesmierne dôležitá metóda, ktorá nám otvára dvere do fascinujúceho sveta našich vlastných obrancov.

Tomáš: Takže, ak som to správne pochopil, mať správne pripravenú bunkovú kultúru je len polovica úspechu. Potom musíme vedieť, čo sa v nej vlastne deje. A tým sa dostávame k našej poslednej, ale o to zaujímavejšej téme na dnes — hematológia.

Nina: Presne tak, Tomáš. A dnes sa pozrieme na dve základné, ale super dôležité techniky. Ako zistiť, ktoré bunky sú ešte nažive a ktoré to už, ehm... vzdali. A potom, ako si ich pekne vyfarbiť, aby sme ich od seba rozoznali.

Tomáš: Znie to trochu morbídne a trochu umelecky. Som zvedavý.

Nina: Je to tak trochu oboje. Začnime tou prvou časťou — kontrolou životnosti buniek. Vieš, v laboratóriu potrebujeme vedieť, aké percento buniek v našej vzorke je v poriadku.

Tomáš: Jasné, aby sme nepracovali s mŕtvym materiálom, však?

Nina: Presne. Na to používame niečo, čo sa volá trypanová modrá. Je to farbivo, ktoré má jednu fascinujúcu vlastnosť.

Tomáš: Akú?

Nina: Živé, zdravé bunky ho do seba nepustia. Ich membrána je ako taký prísny vyhadzovač v klube — selektívne si vyberá, čo ide dnu a čo von.

Tomáš: Chápem. A mŕtve bunky?

Nina: Tie už majú membránu poškodenú. Sú ako ten klub po záverečnej — dvere dokorán, každý môže vojsť. Takže trypanová modrá ich bez problémov zafarbí na modro.

Tomáš: To je geniálne jednoduché! Takže zoberieme vzorku, pridáme trypanovú modrú a pod mikroskopom len spočítame modré a nezafarbené bunky?

Nina: Úplne presne! Použijeme na to špeciálne sklíčko, Búrkerovu komôrku, ktorá má vyrytú mriežku pre ľahšie počítanie. Zmiešame trochu bunkovej suspenzie s farbivom, kvapneme do komôrky a počítame. Zvyčajne rátame do sto buniek a vypočítame percento tých modrých, teda mŕtvych.

Tomáš: Super. Takže prvá záhada, ako oddeliť živých od mŕtvych, je vyriešená. Čo tá umelecká časť, to farbenie?

Nina: Áno, teraz prichádza to, čo je pre diagnostiku kľúčové — Farbenie podľa Pappenheima. Toto je metóda, ktorú používame na farbenie krvných náterov, aby sme mohli rozlíšiť jednotlivé typy bielych krviniek.

Tomáš: Prečo je to potrebné? Nestačí sa na ne len pozrieť pod mikroskopom?

Nina: Nestačí, lebo bez farbenia by vyzerali viac-menej všetky rovnako — ako priesvitné guľôčky. Farbenie je ako dať každej bunke iné tričko. Zrazu vidíš, kto patrí do ktorého tímu — neutrofily, eozinofily, monocyty a tak ďalej.

Tomáš: Aha! Takže to je ten slávny diferenciálny rozpočet leukocytov, o ktorom som počul.

Nina: Presne ten. Používa sa na to zmes farbív. Kľúčový je May-Grünwaldov roztok, ktorý obsahuje eozín, čo je kyslé farbivo, a metylénovú modrú, čo je zásadité. Plus metylalkohol, ktorý bunky najskôr zafixuje, teda „prilepí“ na sklíčko.

Tomáš: Takže rôzne časti bunky reagujú s rôznymi farbivami a podľa toho sa zafarbia inak?

Nina: Presne tak! Kyslé časti bunky, ako jadro, sa zafarbia zásaditou modrou. A zásadité časti, ako niektoré granuly v cytoplazme, zase kyslým červeným eozínom. Vďaka tejto kombinácii dostaneme krásny, pestrofarebný obraz.

Tomáš: Dobre, teóriu máme. Ale ako ten krvný náter vlastne vytvoríme? Predstavujem si, že to nie je len tak kvapnúť krv na sklíčko.

Nina: Máš pravdu, je to tak trochu umenie a veda zároveň. Potrebuješ dve čisté podložné sklíčka. Na jedno nanesieš malú kvapku krvi, asi 20 mikrolitrov.

Tomáš: A potom?

Nina: Potom zoberieš to druhé sklíčko, priložíš ho pred kvapku pod uhlom asi 30 až 40 stupňov. Počkáš, kým sa krv po hrane pekne rozleje...

Tomáš: A potom ho potiahneš? Znie to ako stierkovanie steny.

Nina: V podstate áno, je to taká mini stierka! Potom ho plynulým, rovnomerným pohybom potiahneš po prvom sklíčku. Výsledkom by mal byť tenký, rovnomerný náter, ktorý sa na konci pekne rozstrapká do stratena. Hovorí sa tomu „jazýček“.

Tomáš: Ako viem, že som to urobil správne?

Nina: Dobrý náter je taký tenký, že keď pod neho dáš noviny, stále dokážeš prečítať text. Nesmie byť ani príliš hrubý, ani príliš krátky. Chce to trochu praxe, ale je to základný skill v každom hematologickom labáku.

Tomáš: A keď mám tento umelecký kúsok hotový, nechám ho len tak uschnúť na vzduchu?

Nina: Áno, presne. Necháš ho poriadne zaschnúť a až potom sa púšťame do samotného farbenia.

Nina: Samotné farbenie má niekoľko krokov. Najprv ponoríme sklíčko s náterom do toho May-Grünwaldovho roztoku na asi päť minút. V tejto fáze alkohol fixuje bunky a farbivá začínajú pomaly prenikať dnu.

Tomáš: Čiže zabijeme a nabalzamujeme v jednom kroku.

Nina: Tak nejako. Potom ho prenesieme do zriedeného May-Grünwaldovho roztoku na ďalšiu minútu. A potom príde ďalší hráč — roztok Giemsa-Romanovského.

Tomáš: Ďalšie farbivo?

Nina: Áno, to nám ešte viac zvýrazní detaily, hlavne jadrá buniek. V ňom to necháme tak 10 až 15 minút. Nakoniec to celé len opatrne opláchneme vodou, necháme vysušiť a hotovo. Pripravené na mikroskopovanie.

Tomáš: A čo uvidím? Aká farba je tá „správna“?

Nina: Celý náter by mal mať taký ružovofialový nádych. Ale kľúčové sú detaily. Napríklad granuly eozinofilov by mali byť krásne tehlovočervené. Ak sú bledé, použil si príliš kyslú vodu na riedenie, ak sú sivomodré, tak zase príliš zásaditú. Sú takým naším indikátorom kvality.

Tomáš: Dobre, takže máme zafarbené bunky, vidíme ich krásne pod mikroskopom. Čo ďalej? Ako z toho dostaneme konkrétne čísla?

Nina: Počítame. Pod mikroskopom si nájdeme ideálne miesto na nátere a spočítame sto bielych krviniek. A pri každej si zapíšeme, o aký typ ide — neutrofil, lymfocyt, eozinofil a tak ďalej.

Tomáš: A to nám dá percentuálne zastúpenie. Ale čo celkový počet?

Nina: Celkový počet leukocytov sa zisťuje trochu inak, často ešte pred farbením. Používa sa na to spomínaná Búrkerova komôrka a Türkov roztok, ktorý zničí červené krvinky, aby nám nezavadzali. Potom sa to prepočíta jednoduchým vzorcom. Napríklad, ak v 50 štvorcoch napočítaš 62 leukocytov, výsledok je 6200 leukocytov na mikroliter krvi.

Tomáš: A tieto čísla nám potom môžu povedať veľa o zdravotnom stave, však?

Nina: Obrovské množstvo! Napríklad nízky počet neutrofilov, neutropénia, môže znamenať problém s imunitou a riziko infekcií. Naopak, ich vysoký počet, neutrofília, je typickým znakom akútnej bakteriálnej infekcie.

Tomáš: A čo ostatné? Eozinofily?

Nina: Zvýšené eozinofily? To kričí „parazity“ alebo „alergia“. Zvýšené monocyty zase môžu poukazovať na chronické infekcie. Každá táto subpopulácia má svoj príbeh a ich počty sú kľúčovou stopou pre lekárov.

Tomáš: Páni. Takže od jednoduchej kvapky krvi sa cez precízne nátery a viacstupňové farbenie dostaneme až k detailnej mape našej imunity. Fascinujúce. Dnes sme toho prebrali naozaj veľa.

Nina: To áno. Ale kľúčový odkaz je, že tieto zdanlivo jednoduché techniky — ako odlíšenie živých a mŕtvych buniek pomocou trypanovej modrej, alebo vizualizácia rôznych typov buniek Pappenheimovým farbením — sú absolútnym základom modernej diagnostiky a výskumu.

Tomáš: Je to ako naučiť sa abecedu predtým, ako začneme čítať knihu o ľudskom tele. Nino, ďakujem ti veľmi pekne, že si nám túto „abecedu“ dnes tak pútavo vysvetlila. Bolo to skvelé.

Nina: Aj ja ďakujem za pozvanie, Tomáš. Vždy ma teší, keď môžem tieto veci priblížiť. Sú to naozaj základy, na ktorých stojí celá veda.

Tomáš: A to bol pre dnešok, a vlastne pre celú našu sériu, posledný diel podcastu Studyfi. Dúfame, že ste sa nielen niečo nové naučili, ale že sme vo vás prebudili aj zvedavosť. Ja som Tomáš.

Nina: A ja Nina. Majte sa krásne a nezabudnite, že učenie môže byť dobrodružstvo.

Tomáš: Dovidenia!