Zhrnutie na Hodnotenie mikrobicídnej aktivity fagocytov
Hodnotenie Mikrobicídnej Aktivity Fagocytov: Kompletný Rozbor
Úvod
PMNL testy hodnotia funkčnú aktivitu polymorfonukleárnych leukocytov (PMNL) izolovaných z krvi pomocou kvantitatívnych in vitro metód. Tento materiál sa zameriava na dva typy testov: INT tetrazóliumreduktázový test (metabolická aktivita počas fagocytózy) a testy mikrobicídnej (cídnej) aktivity proti kvasinke Candida albicans. Obsah je prispôsobený samoukom a obsahuje praktické kroky, hodnotenie a tipy pre interpretáciu výsledkov.
Základné pojmy
PMNL (polymorfonukleárne leukocyty): profesionálne fagocyty v periférnej krvi zodpovedné za rýchlu imunitnú odpoveď.
INT (jodnitrotetrazóliová soľ): tetrazóliová soľ použitá na meranie redukčnej/metabolickej aktivity buniek cez tvorbu farbného formazánu.
Cídna aktivita: schopnosť fagocytov zabíjať vnútrobunkové alebo pozabunkové mikroorganizmy po kontakte/ingescii.
Čo testy merajú a prečo sú dôležité
- INT-test meria metabolickú redukčnú aktivitu PMNL počas procesu pripomínajúceho fagocytózu; je rýchly a relatívne jednoduchý.
- Cídne testy priamo kvantifikujú schopnosť PMNL zabiť mikróby (napr. C. albicans) a tak hodnotia mikrobicídne mechanizmy.
Pracovné pomôcky a materiál (stručne)
- Termostat 37 °C, centrifúga, spektrofotometer.
- 10 ml nezrážanej krvi s antikoagulačným činidlom.
- Roztoky na izoláciu leukocytov (metóda osmotickej lýzy erytrocytov), Hanksov roztok pH 7,2.
- INT 0,1 % v Sörensonovom tímivom roztoku; 1 % škrobová suspenzia vo FFR; 1 mol·L^{-1} HCl.
- Skúmavky (10 ml), pipety.
INT tetrazóliumreduktázový test — postup krok za krokom
Príprava buniek
- Izolujte leukocyty z 10 ml krvi podľa protokolu (napr. osmotická lýza erytrocytov). Cieľová koncentrácia: $1 \times 10^{7}\ \text{buniek·ml}^{-1}$.
- Pripravte dve skúmavky: negatívna kontrola (spontánna aktivita) a skúmka so stimuláciou (testovaná vzorka).
Zloženie vzoriek
Použite nasledujúcu schému (objemy v ml):
| Komponent | Vyšetrovaná vzorka | Negatívna kontrola |
|---|---|---|
| Hanksov roztok | 0,5 | 0,5 |
| Bunková suspenzia (2 \times 10^{6} buniek) | 0,2 | 0,2 |
| Škrob (1 %) | 0,1 | - |
| FFR | - | 0,1 |
| INT (0,1 %) | 0,2 | 0,2 |
Inkubácia a spracovanie
- Inkubujte vzorky 45 minút pri 37 °C; premiešavajte každých 10 minút.
- Zastavte reakciu pridaním 1 ml 1 mol·L^{-1} HCl.
- Centrifugujte 5 minút pri 500×g (približne 1600 rpm). Vylejte supernatant.
- K sedimentu pridajte 3 ml metanolu pre extrakciu formazánu; premiešajte a inkubujte 20 minút pri izbovej teplote.
- Centrifugujte 10 minút pri 500×g a zmerajte absorbanciu pri $A_{465}$ spektrofotometrom.
Poznámka: Dodržiavanie rýchlosti a času centrifugácie zabezpečí konzistentné zoskupenie sedimentu a reprodukovateľnosť výsledkov.
Vyhodnotenie INT testu
Index metabolickej aktivity (IMA) vypočítate ako $$ \text{IMA} = \frac{\text{Absorbancia stimulovaných buniek (+)}}{\text{Absorbancia negatívnej kontroly (-)}} $$ Hodnota IMA by mala byť $\geq 2$ pre dostatočnú metabolickú odpoveď.
Test mikrobicídnej (cídnej) aktivity voči C. albicans
Základná myšlienka
- Po kontakte s kvasinkou sa PMNL snažia kandidu zabiť. Testy kvantifikujú zlomok mŕtvych kvasiniek po definovanom čase inkubácie.
Metóda farbenia a mikroskopie (metylénová modrá)
- Po jednoriadkovej inkubácii PMNL so C. albicans lyzujte krvné bunky sodným deoxycholátom.
- Zafarbite uvoľnené C. albicans metylénovou modrou; farba preniká do mŕtvych buniek, živé zostávajú bez farbenia.
- Pripravte mikroskopický náter a spočítajte celkovo napr. 400 kvasiniek, z ktorých zaznamenáte počet mŕtvych.
- Vypočítajte percento cídnej aktivity: $$ %\ \text{cídie} = \frac{\text{Počet mŕtvych C. albicans vo v
Zaregistruj sa pre celé zhrnutieUž máš účet? Prihlásiť sa
PMNL testy - INT a cídna aktivita
Klíčová slova: Fagocytóza, PMNL testy, Respiračné vzplanutie fagocytov, Veterinárna imunológia
Klíčové pojmy: PMNL testy merajú funkčnú aktivitu polymorfonukleárnych leukocytov, INT test využíva tetrazóliovú soľ INT a meria tvorbu formazánu, Cieľová koncentrácia bunkovej suspenzie pre INT je $1 \times 10^{7}\ \text{buniek·ml}^{-1}$, Vzorky pre INT inkubovať 45 min pri 37 °C a zastaviť 1 ml 1 mol·L^{-1} HCl, IMA sa vypočíta ako $\text{IMA} = \frac{A_{+}}{A_{-}}$ a normálne je $\geq 2$, Mikroskopické farbenie metylénovou modrou rozlišuje mŕtve a živé C. albicans, Kultivačná metóda na Sabouraud agare poskytuje priamy počet kolonii po 48 h, Prietoková cytometria je rýchla a citlivá alternatíva pre kvantifikáciu živých/mŕtvych mikroorganizmov, Presné počítanie buniek a kontrola teploty sú kritické pre reprodukovateľnosť, Percento cídie pod 25 % naznačuje možný defekt mikrobicídnych mechanizmov