Podcast o Hodnotenie mikrobicídnej aktivity fagocytov

Kapitoly

Úvod do fagocytózy

Štyri fázy bunkového obeda

Keď sa systém pokazí

Testovanie v praxi

Ako zmerať aktivitu buniek?

Postup INT testu krok za krokom

Vyhodnotenie a index aktivity

Test zabíjania mikróbov

Dve cesty, jeden cieľ

Chemická zbraň bunky

Keď systém zlyhá

Ako to meriame?

Ako testujeme imunitné bunky?

Keď je chyba v génoch

Získané poruchy a ako im predchádzať

Zhrnutie a záver

Přepis

Michal: Existuje jedna vec, ktorá pri téme fagocytózy zamotá hlavu skoro každému študentovi. A prekvapivo, nie je to ten samotný proces „jedenia“ buniek... ale to, ako presne meriame, či naši imunitní bojovníci robia svoju prácu poriadne. Presne na to sa dnes pozrieme, aby ste v tom už nikdy nemali chaos.

Lucia: A garantujeme vám, že po tomto vysvetlení vám to bude pripadať úplne logické. Počúvate Studyfi Podcast.

Michal: Dobre, Lucia, poďme na to od základov. Čo to vlastne tá fagocytóza je? Znie to ako nejaké kúzlo z Harryho Pottera.

Lucia: Skoro! Predstav si to ako upratovaciu a zároveň bezpečnostnú službu nášho tela. Fagocytóza je kľúčový obranný mechanizmus, kde špeciálne bunky, takzvané profesionálne fagocyty, doslova pohlcujú a ničia votrelcov. Baktérie, vírusy, poškodené bunky... všetko zjedia.

Michal: Takže také bunkové Pac-Many? A kto sú títo profesionálni jedáci?

Lucia: Presne tak! Hlavnými hráčmi sú neutrofily, monocyty a tkanivové makrofágy. Sú to naši superhrdinovia v prvej línii vrodenej imunity.

Michal: Dobre, takže máme hladošov. Ale ako ten proces presne prebieha? Asi si len tak nepovedia: „Hej, tam je baktéria, idem si dať.“

Lucia: To veru nie, je to oveľa sofistikovanejšie. Celý proces má štyri hlavné, na seba nadväzujúce kroky. Prvým je migrácia. Fagocyt musí dostať signál, kde je problém, a presunúť sa tam.

Michal: A čo je tým signálom? Taký imunitný SMS-alert?

Lucia: V podstate áno. Sú to takzvané chemotaktické faktory. Môžu to byť kúsky poškodeného tkaniva, časti baktérií alebo špeciálne signálne molekuly ako cytokíny. Tie fagocyt prilákajú na miesto zápalu ako vôňa jedla.

Michal: Fajn, bunka je na mieste. Čo ďalej?

Lucia: Druhý krok je adherencia – prilepenie sa na časticu. Potom nasleduje tretí a najdôležitejší krok: ingescia, čiže samotné pohltenie. Fagocyt obalí časticu svojou membránou a vcucne ju dovnútra. A nakoniec, štvrtý krok, je deštrukcia. Vo vnútri bunky sa votrelcovi pripraví pekelne kyslý a enzýmový kokteil, ktorý ho úplne rozloží.

Michal: Znie to ako dokonalý systém. Čo sa ale stane, ak títo naši Pac-Mani nefungujú správne? Predpokladám, že to nie je dobrá správa.

Lucia: Vôbec nie. Porucha fagocytózy vedie k opakovaným, hlavne bakteriálnym infekciám. Typicky na koži, v dýchacích cestách... A čo je najhoršie, antibiotiká na ne často nezaberajú, pretože chýba podpora imunitného systému, ktorý by „poupratoval“.

Michal: A prečo by zlyhali? Je to vrodené alebo sa to môže stať aj počas života?

Lucia: Môže to byť oboje. Poznáme primárne, čiže vrodené deficiencie, ktoré sú spôsobené genetickými mutáciami. Ale aj sekundárne, získané poruchy. Problém môže byť v hociktorom z tých štyroch krokov – bunky sa nevedia dostať na miesto, nevedia sa prichytiť, alebo im chýbajú nástroje na zničenie pohlteného nepriateľa.

Michal: A tým sa vraciame na začiatok. Ako teda v laboratóriu zistíme, či niekomu fagocyty fungujú správne? Ako ich otestujeme?

Lucia: Je to vlastne celkom priame. Vytvoríme im kontrolované bojisko v skúmavke. Zoberieme vzorku krvi pacienta, kde sú jeho fagocyty, a pridáme k nim niečo, čo majú zjesť. Často sa používa napríklad usmrtená kvasinka, ako je *Candida albicans*.

Michal: Takže im v podstate naservírujeme testovací obed. A čo potom?

Lucia: Presne. Necháme ich spolu inkubovať asi hodinu pri telesnej teplote. Potom spravíme krvný náter, zafarbíme ho a pod mikroskopom sa ideme pozerať, kto bol ako hladný.

Michal: Takže doslova rátame, koľko kvasiniek ktorá bunka zjedla?

Lucia: Áno! Pozeráme sa na 100 fagocytov a zisťujeme dve veci. Po prvé, koľko z nich sa vôbec pustilo do jedla. To nám dá hodnotu zvanú fagocytová aktivita, alebo FA. Mala by byť okolo 75 až 85 %.

Michal: A tá druhá vec?

Lucia: A potom sledujeme, akí boli nenásytní. Spočítame celkový počet zjedených kvasiniek vo všetkých aktívnych bunkách a vypočítame priemer na jednu bunku. To je index fagocytovej aktivity, alebo IFA. Ten by mal byť okolo 3 až 4. Ak sú tieto čísla nízke, vieme, že je problém.

Michal: Takže takto jednoducho odhalíme lenivých bojovníkov. Super, toto už dáva zmysel. Existujú aj modernejšie metódy?

Lucia: Samozrejme. Dnes sa to dá robiť oveľa rýchlejšie a presnejšie pomocou prietokovej cytometrie, kde sa používajú napríklad baktérie označené fluorescenčným farbivom. Ale princíp ostáva rovnaký – zistiť, či naši imunitní Pac-Mani majú stále chuť do jedla.

Michal: Takže vieme, že fagocyty sú naši vnútorní bojovníci, ktorí pohlcujú patogény. Ale ako vlastne zistíme, či si svoju prácu robia poriadne? Existujú na to nejaké testy?

Lucia: Samozrejme, Michal. A presne o tom sa teraz porozprávame. Jedným zo základných testov je takzvaný INT test, ktorý meria metabolickú aktivitu týchto buniek.

Michal: INT test? Znie to ako nejaká tajná skratka.

Lucia: Trochu áno, ale je to celkom priamočiare. Predstav si to tak, že meriame, ako sa bunka „nadýchne“ energie, keď sa chystá do boja. Potrebujeme na to len pár vecí: termostat, centrifúgu a spektrofotometer.

Michal: To znie ako bežné laboratórne vybavenie. A čo chemikálie?

Lucia: Áno, presne tak. Potrebujeme vzorku krvi, nejaké roztoky na izolovanie bielych krviniek a hlavne tú našu „tajnú“ zložku – soľ INT. Tá nám vlastne zafarbí výsledok.

Michal: Dobre, vybavenie máme. Aký je teda postup? Ako to celé prebieha?

Lucia: Je to celkom elegantné. Najprv z krvi izolujeme samotné leukocyty. Potom si pripravíme dve skúmavky.

Michal: Dve? Prečo dve?

Lucia: Skvelá otázka. Jedna je kontrolná, kde meriame bežnú, „spontánnu“ aktivitu buniek v pokoji. A do druhej pridáme stimulátor, v našom prípade škrob, aby sme videli, ako bunky zareagujú pri simulovanej fagocytóze.

Michal: Aha, takže porovnávame bunky „v pohode“ s bunkami „v strese“. Chápem. Čo ďalej?

Lucia: Presne! Do oboch pridáme roztoky vrátane tej našej INT soli. Potom ich inkubujeme pri telesnej teplote, 37 stupňov. Po 45 minútach reakciu zastavíme a pomocou centrifúgy a metanolu z buniek „vytiahneme“ farbivo, ktoré vzniklo.

Michal: A to farebné niečo potom meriame?

Lucia: Presne tak. Intenzitu zafarbenia odmeriame na spektrofotometri. Čím je roztok tmavší, tým boli bunky aktívnejšie. Je to priama úmera.

Michal: A ako zistíme, či je výsledok dobrý alebo zlý?

Lucia: Vypočítame si takzvaný Index metabolickej aktivity, skrátene IMA. Je to jednoduché – vydelíme hodnotu zo stimolovanej vzorky hodnotou z tej kontrolnej.

Michal: Znie to ako matematika, ktorú zvládnem aj ja.

Lucia: Určite áno. A kľúčové je toto: výsledok by mal byť väčší alebo rovný dvom. To nám hovorí, že bunky pri stretnutí s hrozbou svoju aktivitu minimálne zdvojnásobili. Sú pripravené bojovať.

Michal: Dobre, takže vieme zistiť, či sa bunky „naštartujú“. Ale to ešte neznamená, že dokážu nepriateľa aj zničiť, však?

Lucia: Presne tak, Michal! To je ďalší, ešte dôležitejší krok. Musíme otestovať ich mikrobicídnu aktivitu – teda schopnosť zabíjať. Robíme to tak, že im do cesty postavíme skutočného súpera, napríklad kvasinku Candida albicans.

Michal: Dáme ich do ringu a sledujeme zápas.

Lucia: Presne tak! A potom spočítame obete. Existujú na to dva hlavné spôsoby.

Michal: Aké sú to spôsoby?

Lucia: Prvý je mikroskopický. Po inkubácii buniek s kvasinkami ich zafarbíme špeciálnym farbivom, ktoré prenikne len do mŕtvych kvasiniek. Potom pod mikroskopom jednoducho spočítame, koľko z nich to neprežilo.

Michal: Čiže počítame mŕtvoly. Trochu morbidné, ale efektívne. A ten druhý spôsob?

Lucia: Druhý je kultivačný. Zmes zlejeme na agarovú platňu a sledujeme, koľko kvasiniek prežilo a vytvorilo kolónie. Čím menej kolónií, tým lepšie naše fagocyty pracovali.

Michal: Oba postupy znejú dosť prácne a zdĺhavo...

Lucia: A máš pravdu, sú. Sú to klasické metódy, ktoré si vyžadujú veľa času a precíznosti. Našťastie, dnes už máme aj modernejšie alternatívy, napríklad prietokovú cytometriu. A práve na tú sa pozrieme hneď teraz.

Michal: Takže keď už sme prebrali, ako fagocyty pohlcujú patogény, čo sa deje potom? Len ich tak strávia a hotovo?

Lucia: Keby to bolo také jednoduché. Nie, po pohltení spustia niečo, čo sa volá respiračné vzplanutie.

Michal: Vzplanutie? To znie... ako malý výbuch v bunke.

Lucia: A v podstate to tak aj je! Fagocyt po aktivácii začne masívne spotrebúvať kyslík. Je to ako keby sa zhlboka nadýchol predtým, než zaútočí.

Michal: A na čo potrebuje toľko kyslíka?

Lucia: Na výrobu svojich chemických zbraní. Pomocou enzýmu NADPH-oxidáza vytvorí superoxidový anión a z neho ďalšie reaktívne látky ako peroxid vodíka. Tieto látky sú pre baktérie extrémne toxické.

Michal: Takže v podstate na votrelca vypustí smrtiacu zmes chemikálií. To je celkom drsné.

Lucia: Presne tak. Je to veľmi efektívny spôsob, ako zničiť pohltené mikroorganizmy. Je to kľúčová súčasť našej obrany.

Michal: A čo sa stane, ak tento systém nefunguje správne?

Lucia: To je, samozrejme, veľký problém. Existuje ochorenie nazývané chronická granulomatózna choroba. Je spôsobená mutáciou práve v génoch pre tú kľúčovú NADPH-oxidázu.

Michal: Čiže ich bunky nevedia "vzplanúť"?

Lucia: Presne. A výsledkom sú časté a vážne infekcie, hlavne od baktérií a plesní, ktoré by zdravý imunitný systém ľahko zneškodnil. Ide o pneumónie, abscesy alebo kožné infekcie.

Michal: Dobre, a ako v laboratóriu zistíme, či niekomu funguje toto respiračné vzplanutie správne?

Lucia: Používame na to rôzne testy. Jedným z najčastejších je takzvaný INT alebo MTT test. Izolujeme biele krvinky a pridáme k nim niečo, čo ich vyprovokuje k akcii, napríklad zymozan.

Michal: A potom sledujeme, či sa "nadýchnu"?

Lucia: Skoro. Pridáme tam špeciálnu látku, tetrazóliovú soľ. Ak bunka spustí vzplanutie a začne produkovať tie reaktívne látky, táto soľ sa v nej zmení na nerozpustný fialový formazán.

Michal: Takže čím fialovejšia vzorka, tým silnejšia imunitná odpoveď?

Lucia: Presne si to vystihol! Je to krásny vizuálny dôkaz, že fagocyty robia svoju prácu. A odtiaľto sa môžeme plynule presunúť na ďalšie funkčné testy...

Michal: A tým sa dostávame k nášmu poslednému dnešnému bloku, Lucia. Znie to dosť odborne... veterinárna imunológia. Ale v podstate sa pozrieme na to, ako zisťujeme, či imunitný systém zvierat funguje správne, však?

Lucia: Presne tak, Michal. Po všetkej teórii je čas na prax. A je to kľúčové, pretože ak imunitný systém zlyháva, potrebujeme vedieť prečo a ako to napraviť.

Michal: Dobre, tak ako na to ideme? Ako taký imunitný systém... otestujeme? Dáme mu písomku?

Lucia: Skoro. Robíme mu skôr taký fyzický záťažový test. Jedna zo základných metód sa volá INT test. V podstate ním meriame, ako dobre si fagocyty, teda tie naše „upratovacie“ bunky, plnia svoju prácu.

Michal: Čiže či poctivo „upratujú“ pohltené baktérie?

Lucia: Presne tak. Výsledok nám dá takzvaný index metabolickej aktivity. Vďaka nemu vieme zistiť, či je problém v tom, že bunka nevie patogén pohltiť, alebo ho síce pohltí, ale nevie ho zničiť.

Michal: Aha, takže vieme presne určiť, kde v tom procese nastala chyba. To je dosť dôležité.

Lucia: Je to kľúčové pre správnu diagnózu. A dnes na to máme aj modernejšie metódy, napríklad prietokovú cytometriu. Tam bunky označíme farbičkou a doslova sledujeme, ako sa im rozsvieti „kontrolka“, keď začnú produkovať kyslíkové radikály na zabíjanie baktérií.

Michal: To znie ako nejaká diskotéka pre imunitné bunky.

Lucia: Dá sa to tak povedať. Testy ako PHAGOBURST® fungujú presne na tomto princípe. Je to rýchle a veľmi presné.

Michal: Super. Takže to sú testy. Ale čo sú tie najčastejšie problémy, ktoré u zvierat odhalia? Sú niektoré poruchy vrodené?

Lucia: Áno, a niektoré sú dokonca typické pre konkrétne plemená. Najznámejší príklad je asi BLAD – Bovinná leukocytová adhézna deficiencia. Je to ochorenie holsteinského dobytka.

Michal: Čo to presne znamená? Adhézna deficiencia... znie to, akoby sa tie bunky nevedeli na nič prilepiť.

Lucia: Perfektná analógia. Presne o to ide. Týmto bunkám chýba kľúčová molekula, také „lepidlo“, vďaka ktorému by sa prichytili na stenu cievy a dostali sa von k infekcii.

Michal: Takže zostanú uväznené v krvnom obehu a v mieste zápalu chýbajú. To je problém.

Lucia: Obrovský. Zvieratá potom trpia opakovanými infekciami, zlou hojivosťou rán a majú extrémne vysoký počet bielych krviniek v krvi... lebo sa nevedia nikam dostať. Našťastie, dnes to vieme ľahko odhaliť pomocou PCR testu a takéto zvieratá vyradiť z chovu.

Michal: A je niečo podobné aj u iných zvierat?

Lucia: Áno, existuje CLAD u psov, čo je v podstate to isté, a tiež Chédiakov-Higashiho syndróm, ktorý bol popísaný u mačiek, tigrov či noriek. Tam je problém s obrovskými granulami v bunkách, ktoré môžu prasknúť a poškodiť tkanivo.

Michal: Dobre, takže nie vždy je na vine genetika. Čo ešte môže oslabiť imunitu zvieraťa?

Lucia: Tých faktorov je, bohužiaľ, celkom dosť. Hovoríme im získané deficity. Môže ísť o rôzne vírusové infekcie, napríklad vírus mačacej leukémie alebo FIV, teda mačací AIDS.

Michal: To dáva zmysel, vírusy sú známe tým, že vedia imunitu pekne rozhodiť.

Lucia: Presne. Ale patrí sem aj podvýživa, a to nielen nedostatok vitamínov či minerálov, ale pozor, aj obezita. Aj tá je pre imunitu záťažou.

Michal: To je dôležitý bod. Čo ďalej?

Lucia: Potom je tu stres. Transport, nadmerná záťaž, trauma... to všetko imunitu oslabuje. Rovnako aj niektoré lieky, napríklad kortikosteroidy, alebo toxíny z prostredia, vrátane mykotoxínov z plesní v krmive.

Michal: Takže je to komplexný problém. Kľúčom je teda nielen dobrá genetika, ale aj celková starostlivosť, výživa a manažment stresu.

Lucia: Jednoznačne. Práve toto je tá message, ktorú si treba odniesť. Správnou starostlivosťou vieme predísť mnohým sekundárnym infekciám, ktoré sú dôsledkom oslabenej imunity.

Michal: Výborne. Takže, aby sme to zhrnuli. Dnes sme sa pozreli na metódy, ktorými zisťujeme funkčnosť imunity, ako sú INT testy či prietoková cytometria. Prebrali sme vrodené poruchy, ako je BLAD u dobytka, ale aj tie získané, ktoré môže spôsobiť stres, zlá strava či rôzne infekcie.

Lucia: Presne tak. A hlavne sme si povedali, že zdravá imunita je základom zdravia celého zvieraťa a že my, ako majitelia a budúci odborníci, máme veľa nástrojov na to, aby sme ju podporili.

Michal: Super. Týmto sme na konci dnešnej epizódy Studyfi Podcastu. Lucia, opäť raz ďakujem za skvelé a zrozumiteľné vysvetlenia.

Lucia: Aj ja ďakujem za pozvanie, Michal. Bolo mi potešením!

Michal: A vám, milí poslucháči, ďakujeme, že ste boli s nami. Dúfame, že ste si odniesli kopec užitočných informácií. Nezabudnite, že s dobrou prípravou to zvládnete. Počujeme sa pri ďalšej epizóde!