Resumo de Técnicas de Biologia Molecular Essenciais

## Introdução Os retrovírus são vírus de RNA que utilizam uma enzima chamada **transcriptase reversa** para converter o seu genoma de RNA em DNA, permitindo a integração no genoma do hospedeiro. A técnica PCR e a variante RT-PCR são ferramentas centrais para detetar e amplificar sequências de DNA (ou cDNA) geradas por retrovírus, sendo essenciais em investigação biomédica e diagnóstico. > **Definição:** Retrovírus — vírus de RNA que incorporam o seu material genético no DNA do hospedeiro através da síntese de DNA complementar por transcriptase reversa. ## Ciclo de infeção dos retrovírus (visão geral) 1. Entrada na célula hospedeira por fusão ou endocitose. 2. Libertação do genoma de RNA e das proteínas virais no citoplasma. 3. Conversão do RNA viral em DNA de dupla cadeia (dsDNA) pela **transcriptase reversa**. 4. Transporte do dsDNA ao núcleo e **integração** no genoma do hospedeiro. 5. Transcrição do provírus por RNA polimerase II do hospedeiro e produção de novos genomas virais e proteínas estruturais. 6. Montagem e libertação de novos virions. ### Subprocessos relevantes - Síntese de cDNA (transcrição reversa). - Integração do cDNA no genoma do hospedeiro. - Produção de novos genomas de RNA e proteínas virais. > **Definição:** Provírus — forma integrada do genoma viral no DNA do hospedeiro que atua como molde para produção de novos vírus. ## Transcriptase reversa: mecanismo e características - É uma **RNA-dependente DNA-polimerase** que usa RNA como molde para sintetizar DNA. - Requer um **primer** para iniciar a síntese; nos retrovírus esse primer é geralmente um tRNA celular. - Não dispõe de atividade **proofreading** (exonuclease 3'→5'), pelo que tem uma taxa de erro elevada. > **Definição:** Transcriptase reversa — enzima que sintetiza DNA a partir de um molde de RNA. ### Consequências da alta taxa de erro - Elevada mutabilidade dos retrovírus; por exemplo, a transcriptase reversa do HIV tem uma taxa de erro aproximada de 1 erro por 20 000 nucleótidos. - Rápida emergência de novas estirpes e variantes, dificultando o tratamento e exigindo vigilância contínua. ### Estrutura e homologia - A porção catalítica da transcriptase reversa lembra o fragmento Klenow da DNA polimerase I (Pol I) em termos de estrutura tridimensional. ## Transcrição reversa e RT-PCR - A **transcrição reversa** é o processo que sintetiza DNA complementar (cDNA) a partir de RNA. - **RT-PCR (Reverse Transcription-PCR)** combina transcrição reversa com PCR para detetar e amplificar sequências originalmente presentes como RNA. > **Definição:** RT-PCR — técnica que converte RNA em cDNA por transcriptase reversa e amplifica o cDNA por PCR. ### Aplicações práticas do RT-PCR - Detetar infeções por vírus de RNA, como retrovírus (ex.: monitorização de carga viral do HIV em pesquisa). (Nota: não abordar técnicas de Biologia Molecular detalhadas ou análises forenses.) - Estudos de expressão gênica quando o alvo inicial é RNA. ## A técnica PCR: potencial e cuidados - A PCR pode detetar e amplificar até uma única molécula de DNA presente numa amostra, tornando-a extremamente sensível. > **Definição:** PCR — técnica que amplifica exponenencialmente segmentos específicos de DNA usando primers específicos, polimerase termoestável, e ciclos térmicos. ### Aplicações (não forenses nem técnicas moleculares detalhadas) - Deteção de infeções virais em amostras clínicas. - Estudos da evolução de vírus patogénicos por amplificação de sequências virais. - Diagnóstico pré-natal de doenças genéticas (quando aplicável). ### Cuidados experimentais - Devido à sensibilidade, a **contaminação** é um risco constante; podem amplificar-se sequências contaminantes de investigadores ou de bactérias do ambiente. - É essencial incluir controlos negativos e positivos: controlos sem molde, controlos de reagentes, e, quando necessário, controlos de extracao. ## Tabela comparativa: Transcriptase reversa vs DNA polimerase clássica | Característica | Transcriptase reversa (retr