Resumo de Cinética Enzimática: Curva de Progresso e Prática

## Introdução A **curva de progresso enzimática** é uma representação gráfica que mostra como uma reação catalisada por uma enzima avança ao longo do tempo, registrando a quantidade de produto formado ou substrato consumido em diferentes instantes. Neste material, focaremos nos conceitos práticos e experimentais para projetar e analisar uma curva de progresso, usando como exemplo a liberação de fosfato inorgânico (Pi) em uma reação catalisada por uma fosfatase alcalina (FA). > **Definição:** Uma curva de progresso é o gráfico da quantidade de produto (ou substrato restante) em função do tempo, usado para determinar velocidades iniciais e fases cinéticas de uma reação enzimática. ## Conceitos-chave detalhados ### Que informações uma curva de progresso fornece? - A **velocidade inicial** da reação, medida na fase linear inicial. - A transição entre a fase **linear** (pouca acumulação de produto) e a **desaceleração** (limitação por substrato, produto ou inativação enzimática). - Efeitos de condições experimentais: pH, temperatura, concentração de substrato e enzima, presença de inibidores ou ativadores. ### Componentes essenciais de um experimento para curvas de progresso 1. Preparação da mistura de reação (enzima + substrato + tampão/cofatores). 2. Parada da reação em tempos predeterminados por meio de um agente que interrompe a atividade enzimática (neste caso, molibdato de amônio). 3. Quantificação do produto formado com uma técnica colorimétrica (desenvolvimento de cor pela redução do complexo fosfomolíbdico). 4. Construção do gráfico: quantidade de produto vs. tempo. > **Definição:** Velocidade inicial: a inclinação da curva de progresso na porção linear mais inicial, que reflete a atividade instantânea da enzima sob essas condições. ### Delineamento experimental — elementos e sua função - **Enzima FA**: fonte de atividade enzimática. Trabalha-se com uma solução concentrada e realizam-se diluições para obter atividades mensuráveis. - **β-glicerol-fosfato (β-glicerol P)**: substrato a 100 mM. - **Tampão de reação (Glicina 0.1 M + MgCl2 10 mM)**: mantém o pH e fornece o cofator Mg2+. - **Molibdato de amônio**: interrompe a reação formando um complexo com Pi. - **Solução redutora**: reduz o complexo ácido fosfomolíbdico para gerar cor mensurável. - **Solução padrão de Pi (1 mM)**: tubo padrão para construir curva padrão e converter absorbâncias para nmoles de Pi. - **Equipamentos**: espectrofotômetro, micropipetas, vórtex, banho termorregulado, cronômetro, tubos, cubetas. ### Procedimento geral (resumido) 1. Preparar a mistura de reação com volume e concentrações definidas. 2. Incubar a temperatura controlada; iniciar a reação com adição de enzima ou substrato. 3. Em intervalos de tempo predeterminados, extrair alíquotas e interromper a reação com molibdato. 4. Adicionar reagente redutor para desenvolver cor. 5. Medir a absorbância em espectrofotômetro e converter para quantidade de Pi por meio da curva padrão. ## Análise de dados ### Construção da curva - Eixo x: tempo (s ou min). - Eixo y: quantidade de produto (nmols de Pi) ou absorbância convertida para nmols. ### Cálculo da velocidade inicial - Selecionar os primeiros pontos que exibam uma relação linear. - Ajustar uma reta por regressão linear; a inclinação é a velocidade inicial $v_0$ em nmol/min ou unidades correspondentes. > **Definição:** Curva padrão: série de soluções de Pi com concentrações conhecidas usadas para correlacionar absorbância com nmols de Pi. ### Interpretação de fases - Fase linear: a enzima trabalha sem limitação apreciável, ideal para medir $v_0$. - Desaceleração: pode indicar esgotamento de substrato, inibição por produto, desnaturação ou mudança nas condições. ## Exemplo prático (conceitual) Suponhamos que foram feitas medições de Pi liberado a cada 30 s durante 5 min e foram obtidos os seguintes valores em nanomols: $0$, $2.1$, $4.3$, $6.5$, $8.0$, $9.1$, $9.8$, $10.0$, $10.1$, $10.1$. Os primeiros 4 pontos mostram linearidade