Podcast o Sekwencjonowanie DNA: Metody i zastosowania kliniczne

Přepis

Kristýna: Martinie, na pewno widziałeś te filmy, gdzie detektyw bierze próbkę włosa z miejsca zbrodni i w ciągu kilku godzin ma kompletny profil DNA sprawcy. Albo te reklamy testów, które mówią ci, skąd dokładnie pochodzili twoi pra-pra-pradziadkowie. Jak oni właściwie potrafią odczytać coś tak skomplikowanego jak DNA?

Martin: Świetne pytanie, Kristýno! To nie jest tak szybko jak w filmie, ale zasada jest fascynująca. I właśnie to „czytanie DNA” jest podstawą współczesnej medycyny. Słuchacie Studyfi Podcast.

Kristýna: Czyli sekwencjonowanie DNA to w zasadzie… czytanie kodu genetycznego?

Martin: Dokładnie tak. To zbiór metod, które pozwalają nam określić dokładną kolejność liter – nukleotydów A, T, C i G – w cząsteczce DNA. A to jest kluczowe, bo wiele chorób dziedzicznych jest spowodowanych tylko małą zmianą, na przykład jedną jedyną literówką w tym ogromnym tekście.

Kristýna: Dobrze, a jak to się robi? Od czego w ogóle się zaczęło?

Martin: Wszystko to zapoczątkowała tak zwana metoda Sangera. To taki dziadek sekwencjonowania, ale wciąż niesamowicie niezawodny. Działa na zasadzie kontrolowanego zatrzymywania syntezy DNA.

Kristýna: Kontrolowane zatrzymywanie? Brzmi jak korek na poziomie molekularnym.

Martin: Dokładnie! Wyobraź to sobie tak: Masz enzym, polimerazę DNA, która kopiuje nić DNA. A do mieszaniny dodajesz zwykłe bloki budulcowe, nukleotydy, ale też kilka specjalnych, którym brakuje jednej ważnej części. Nazywamy je dideoksynukleotydami.

Kristýna: A co robią te specjalne bloki?

Martin: To tacy sabotażyści. Gdy tylko jeden z nich zostanie wbudowany w nową nić, synteza natychmiast się zatrzymuje. Koniec. Dalej nie idzie. Ponieważ każdy typ tego „stop” nukleotydu świeci innym kolorem, wiemy dokładnie, którą literą kończy się ten konkretny odcinek.

Kristýna: Czyli wynikiem jest mnóstwo różnej długości, kolorowo oznaczonych kawałków DNA?

Martin: Bingo. A te kawałki potem układamy według wielkości za pomocą elektroforezy kapilarnej. To jak wyścig, gdzie mniejsze i lżejsze fragmenty biegną szybciej. Na końcu jest detektor, który odczytuje kolory, gdy te przechodzą obok, a komputer z tego składa końcową sekwencję.

Kristýna: A co jeśli jest tam jakiś błąd, mutacja?

Martin: To pięknie się pokaże. Jeśli masz na przykład wariant w stanie heterozygotycznym – czyli jedną kopię genu zdrową, a jedną zmienioną – zobaczysz w tym miejscu dwa sygnały kolorystyczne nałożone na siebie. Metoda jest super precyzyjna, ale ma haczyk.

Kristýna: A jaki jest ten haczyk? Brzmi to całkiem doskonale.

Martin: Jest wolna i droga dla dużych analiz. Potrafi odczytać tylko jeden stosunkowo krótki odcinek naraz, tak do tysiąca liter. Jest świetna do weryfikacji konkretnej, znanej mutacji w rodzinie lub do analizy małego genu. Ale sekwencjonowanie w ten sposób całego genomu trwałoby wiecznie i kosztowałoby majątek.

Kristýna: Czyli do dużych projektów, takich jak analiza tysięcy genów naraz, potrzebujemy już czegoś szybszego i wydajniejszego?

Martin: Dokładnie tak. I właśnie tam wkraczają metody nowej generacji, znane jako NGS. Ale o nich opowiemy sobie innym razem.

Kristýna: Czyli metoda Sangera jest świetna do odczytywania jednego konkretnego kawałka DNA, takiego genetycznego akapitu. Ale co jeśli potrzebujemy przeczytać całą książkę, albo od razu całą bibliotekę?

Martin: Dokładnie tak, Kristýno. I właśnie dlatego teraz na scenę wkracza sekwencjonowanie nowej generacji, czyli NGS.

Kristýna: NGS, brzmi jak coś z przyszłości. Co to dokładnie oznacza?

Martin: To właściwie zbiorcza nazwa dla technologii sekwencjonowania drugiej generacji. Po polsku mówi się na to też masowo równoległe sekwencjonowanie. A to słowo „równoległe” jest kluczowe.

Kristýna: Równoległe? Czyli nie robi jednej rzeczy po drugiej?

Martin: Dokładnie. Zamiast odczytywać jeden obszar DNA po drugim, jak Sanger, NGS analizuje miliony i miliony fragmentów DNA… i to wszystko naraz. To jak czytanie wszystkich książek w bibliotece jednocześnie.

Kristýna: Wow, to musi być niesamowicie efektywne. Do czego to się przydaje w praktyce?

Martin: Ogromnie to pomaga w genetyce medycznej. Wiele chorób jest bowiem genetycznie heterogennych.

Kristýna: Heterogennych? To znaczy, że te same objawy mogą być spowodowane mutacjami w zupełnie innych genach?

Martin: Tak. Wyobraź sobie na przykład padaczkę, zaburzenia słuchu czy choroby serca. Dzięki NGS możemy naraz sprawdzić wszystkie geny, które mogą mieć z tym związek, i znaleźć tę właściwą przyczynę znacznie szybciej.

Kristýna: Dobrze, czyli możemy analizować mnóstwo genów naraz. Czy istnieją różne sposoby, żeby to zrobić?

Martin: Oczywiście. W zależności od zakresu wyróżniamy trzy podstawowe typy. Pierwszy to ukierunkowany panel genowy.

Kristýna: Brzmi, jakbyśmy skupili się na konkretnych podejrzanych, prawda?

Martin: Dokładnie tak. Wybieramy sobie na przykład grupę genów związanych z dziedzicznymi nowotworami i analizujemy tylko je. Jest to tańsze, szybsze w interpretacji i mamy tam świetne pokrycie.

Kristýna: Ale co jeśli sprawca jest poza naszą listą podejrzanych?

Martin: Dobre pytanie. Dla takich przypadków mamy sekwencjonowanie eksomu. To skupia się na wszystkich eksonach – czyli kodujących obszarach wszystkich genów.

Kristýna: A to jest duża część genomu?

Martin: Zaskakująco nie. Eksony stanowią tylko około jednego do dwóch procent genomu, ale zawierają większość znanych mutacji, które powodują choroby. A potem jest oczywiście… cały genom.

Kristýna: Sekwencjonowanie genomu. To już ta kompletna biblioteka, włącznie z notatkami na marginesach i pustymi stronami?

Martin: Świetna analogia. Analizujemy absolutnie wszystko – obszary kodujące i niekodujące. Jest to najdroższe i najbardziej wymagające pod względem danych, ale może ujawnić warianty, które w innym przypadku by nam umknęły.

Kristýna: Fascynujące. A jaka technologia za tym wszystkim stoi? Słyszałam o platformie Illumina.

Martin: Tak, Illumina jest dziś najszerzej stosowana w praktyce klinicznej. Jej zasada nazywa się „sequencing by synthesis”, czyli sekwencjonowanie przez syntezę.

Kristýna: Sekwencjonowanie przez syntezę… Czyli my to DNA właściwie budujemy na nowo i przy tym je odczytujemy?

Martin: Dokładnie. Obserwujemy polimerazę DNA, jak do pierwotnej nici stopniowo dodaje nowe nukleotydy. A teraz pojawia się ten trik – każdy typ nukleotydu, czyli A, C, G i T, jest oznaczony innym kolorem i ma na sobie tymczasową „blokadę”.

Kristýna: Czekaj, blokadę?

Martin: Tak, grupę chemiczną, która zapobiega dodaniu kolejnego nukleotydu. Więc w każdym cyklu dodaje się dokładnie jeden. My potem laserem wszystko „oświetlamy”, kamera fotografuje kolory i wiemy, jaka zasada się gdzie przyłączyła.

Kristýna: A potem ta blokada jest usuwana i idzie się dalej? Jak taki kolorowy genetyczny semafor.

Martin: To jest to! Blokada jest usuwana i cykl się powtarza. W ten sposób stopniowo odczytujemy krótkie odcinki, które nazywamy „ready”.

Kristýna: Dobrze, tę zasadę rozumiem. Ale jak te kawałki DNA w ogóle się tam dostają? Co jest na początku?

Martin: Wszystko zaczyna się od przygotowania tak zwanej biblioteki. DNA pacjenta jest losowo fragmentowane na małe kawałki.

Kristýna: Jakbyśmy podarli książkę na małe karteczki.

Martin: Dokładnie tak. Na końce tych karteczek naklejamy potem specjalne „etykiety adresowe”, adaptery. Dzięki nim fragmenty mogą przyczepić się do specjalnej płytki, którą nazywamy flow cell.

Kristýna: A co dzieje się na tej płytce?

Martin: Tam każdy fragment jest wielokrotnie kopiowany w procesie zwanym „amplifikacją mostkową”. Powstaje w ten sposób skupisko identycznych kopii, które nazywamy klastrem. Dzięki temu sygnał kolorystyczny podczas sekwencjonowania jest wystarczająco silny, żeby kamera go uchwyciła.

Kristýna: Czyli z jednej karteczki robimy tysiąc, żeby porządnie świeciła. A potem już tylko fotografujemy kolory, cykl po cyklu.

Martin: Tak. A na końcu uzyskujemy ogromną ilość danych w plikach FASTQ. Zawierają one nie tylko sekwencje, ale także informację o jakości dla każdej odczytanej zasady. A potem wkracza bioinformatyka.

Kristýna: Gdzie więc NGS znajduje zastosowanie w praktyce?

Martin: Głównie u dzieci z opóźnieniem rozwojowym lub wadami wrodzonymi, gdzie często odkrywamy zupełnie nową, de novo mutację. Także w onkologii, czy to przy poszukiwaniu dziedzicznych predyspozycji do nowotworów, czy przy analizie samego nowotworu dla wyboru ukierunkowanego leczenia.

Kristýna: To ma sens. A co z kwestiami etycznymi? Co jeśli podczas badania genomu znajdziecie coś, czego w ogóle nie szukaliście?

Martin: To świetna uwaga. Te odkrycia nazywamy wtórnymi lub przypadkowymi. Możemy na przykład u pacjenta z padaczką znaleźć wariant, który zwiększa ryzyko raka w przyszłości.

Kristýna: Wow. Pacjent musi o tym wiedzieć z góry, prawda?

Martin: Zdecydowanie. Właśnie dlatego kluczowa jest świadoma zgoda. Pacjent musi zdecydować, czy chce znać takie informacje. To złożony temat, który wymaga starannej porady genetycznej.

Kristýna: Martinie, gdybyśmy mieli to podsumować dla studentów, którzy przygotowują się do egzaminu. Jaka jest największa różnica między Sangerem a NGS?

Martin: Dobrze, przejdźmy do tego. Zapamiętajcie, że Sanger to pierwsza generacja – odczytuje jeden odcinek, jest super precyzyjny, ale wolny dla dużych projektów. NGS to druga generacja – masowo równoległa, odczytuje miliony fragmentów naraz.

Kristýna: A zasada działania Illumini?

Martin: Sekwencjonowanie przez syntezę. Kolorowo oznakowane nukleotydy z tymczasową blokadą, tworzenie biblioteki, amplifikacja do klastrów na flow cell i cykliczne rejestrowanie kolorów.

Kristýna: A zastosowanie kliniczne?

Martin: Głównie diagnostyka chorób genetycznie heterogennych, onkogenetyka i medycyna spersonalizowana. Ale uwaga, negatywny wynik nie oznacza, że nie ma tam żadnego problemu. Zawsze trzeba interpretować wynik w kontekście stanu klinicznego pacjenta.

Kristýna: Perfekcyjnie. To było wyczerpujące, a jednocześnie zrozumiałe podsumowanie. Dzięki wielkie!

Martin: Nie ma za co. To fascynujący świat, który nieustannie przesuwa granice medycyny.

Kristýna: To zdecydowanie. A przesuwać granice będziemy i my. Następnym razem przyjrzymy się, jak te ogromne stosy danych z NGS są właściwie przetwarzane i co wszystko można z nich wyczytać. Więc skupimy się na bioinformatyce.

Kristýna: Wow, to jest naprawdę złożone. Ale to prowadzi nas do naszego ostatniego dzisiejszego tematu, który świetnie się z tym wiąże – co właściwie dzieje się z tymi danymi? Przyjrzyjmy się sekwencjonowaniu i interpretacji NGS.

Martin: Dokładnie tak. A żeby zrozumieć NGS, czyli sekwencjonowanie nowej generacji, dobrze jest porównać je z jego poprzednikiem, sekwencjonowaniem Sangera.

Kristýna: Jasne, to ta bardziej klasyczna metoda. W czym tkwi główna różnica?

Martin: Wyobraź to sobie tak. Sekwencjonowanie Sangera jest jak czytanie jednego konkretnego rozdziału książki, ale za to bardzo starannie i z doskonałym zrozumieniem. NGS jest jak posiadanie armii asystentów, którzy błyskawicznie odczytają fragmenty ze wszystkich książek w całej bibliotece naraz.

Kristýna: Czyli Sanger jest do małego, ukierunkowanego odcinka, a NGS do masowego poszukiwania w wielu genach jednocześnie?

Martin: Dokładnie. NGS daje nam ogromną ilość danych, ale w postaci krótkich odcinków, które muszą zostać złożone w całość. Dlatego tak ważna jest ta kolejna, bioinformatyczna część.

Kristýna: I dlatego negatywny wynik w NGS automatycznie nie oznacza, że pacjent jest genetycznie w porządku?

Martin: Zgadza się. Mogliśmy akurat minąć się z obszarem, który metoda słabo pokrywa, albo szukana zmiana leży poza genami. To potężne narzędzie, ale nie nieomylne.

Kristýna: Dobrze, czyli mamy stos tych krótkich odczytanych odcinków. Co dalej? Jak z tego chaosu powstanie użyteczny wynik?

Martin: To proces składający się z kilku kroków. Najpierw kontrola jakości, potem wyrównanie tych krótkich odczytów do genomu referencyjnego – to taka uniwersalna mapa ludzkiego DNA.

Kristýna: A kiedy wszystkie elementy układanki są na swoim miejscu?

Martin: Wtedy następuje „wywoływanie wariantów”. Program komputerowy porównuje naszą sekwencję z referencją i oznacza wszystkie różnice. Te różnice nazywamy wariantami.

Kristýna: Ale nie każda różnica oznacza problem, prawda? Każdy z nas jest przecież trochę inny.

Martin: Dokładnie. I to jest najważniejsza i najtrudniejsza część. Interpretacja. Każdy wariant musimy ocenić. Czy jest rzadki? Czy zmienia jakąś funkcję białka? Czy ktoś już go opisał u pacjentów z podobnymi dolegliwościami?

Kristýna: A jak więc są klasyfikowane? Zakładam, że to nie jest tylko „dobra” czy „zła”.

Martin: Oby. Mamy pięć klas: od łagodnej, czyli nieszkodliwej, aż po patogenną, która powoduje chorobę. Ale między nimi jest szara strefa…

Kristýna: Szara strefa?

Martin: Wariant o niepewnym znaczeniu, czyli VUS. Wiemy, że tam jest, ale nie mamy wystarczających dowodów, żeby powiedzieć, czy jest nieszkodliwa, czy wręcz przeciwnie, szkodliwa. A z takim wynikiem w klinice trzeba pracować bardzo ostrożnie.

Kristýna: Czyli to wymaga nie tylko świetnych maszyn, ale przede wszystkim świetnych umysłów, które to wszystko interpretują. Fascynujące. Martinie, bardzo ci dziękuję za dzisiejszy wgląd w genetykę.

Martin: Ja dziękuję za zaproszenie. Mam nadzieję, że pomogło to słuchaczom zajrzeć pod podszewkę naszej dziedziny.

Kristýna: Na pewno tak. Więc w imieniu całego zespołu Studyfi Podcastu życzymy wam miłego dnia i do usłyszenia w kolejnym odcinku.