Shrnutí na DNS-szekvenálás: Módszerek és klinikai alkalmazások
DNA szekvenálás: Módszerek, alapelvek és klinikai alkalmazások
Bevezetés
Ez az anyag bemutatja, hogyan dolgozzák fel és értelmezik az NGS (új generációs szekvenálás) adatait a klinikai genetikában. A célja, hogy áttekintést nyújtson az elemzési lépésekről, a módszerek előnyeiről és korlátairól, valamint gyakorlati útmutatót adjon a variánsok helyes értelmezéséhez, anélkül, hogy megismételné magának a szekvenálásnak az alapelveit.
Áttekintés: Sanger és NGS – Mikor melyiket válasszuk?
| Kritérium | Sanger-szekvenálás | NGS |
|---|---|---|
| Elemzés hatóköre | rövid, célzott szakasz | kiterjedt, párhuzamos vizsgálat számos génen |
| Olvasat hossza | hosszú és könnyen értelmezhető | rövid olvasatok, melyek összeállítást igényelnek |
| Sebesség és költség nagy volumen esetén | lassú, drága | magas áteresztőképesség, alacsonyabb költség bázisonként |
| Elemzés | egyszerű kromatogram | bioinformatikai feldolgozást igényel |
Definíció: A Sanger-szekvenálás rövid, célzott régiók ellenőrzésére alkalmas, míg az NGS nagyszámú gén párhuzamos vizsgálatát teszi lehetővé, és magas adatátviteli kapacitást biztosít.
Gyakorlati alkalmazás
- Sanger: egy specifikus, ismert variáns ellenőrzése vagy NGS eredmények validálása.
- NGS: diagnosztika heterogén diagnózisú esetekben, génpanelek, exom- vagy genomszekvenálási vizsgálatok.
Tudta, hogy az NGS gyakran feltárja a betegség okát még ott is, ahol előzetesen nem volt egyértelmű jelölt gén?
Az NGS adatok elemzésének alapvető lépései
-
A nyers adatok minőségellenőrzése
- Értékeljük az adatok mennyiségét, a bázisok minőségét, az olvasatok hosszát, az adapterek jelenlétét és a futtatás általános sikerességét.
- A rossz minőségű bázisok vagy az adapterek eltávolításra kerülnek (trimming).
-
Igazítás a referencia genomhoz
- A referencia genom térképként szolgál, amelyhez a szoftver hozzárendeli az egyes olvasatokat.
-
A lefedettség értékelése
- Lefedettség = hányszor olvasták le az adott pozíciót; a magasabb lefedettség növeli a detektált variánsok megbízhatóságát.
-
Variánsok detektálása
- Az algoritmusok azonosítják a referencia szekvenciától való eltéréseket: SNV-ket (egynukleotidos variánsok), kis ins/del-eket, esetleg CNV-ket vagy strukturális változásokat megfelelő beállítások esetén.
-
Variánsok annotációja
- A variánshoz a következő információk kerülnek hozzáadásra: gén, proteinre gyakorolt hatás, gyakoriság a populációban, adatbázisokban lévő bejegyzések, fenotípussal való kompatibilitás.
Definíció: A lefedettség (coverage) azt a független olvasatok számát jelöli, amelyek egy adott nukleotid pozíciót fednek le; a magas lefedettség csökkenti a detektálási hiba valószínűségét.
Gyakorlati elemzési példa
- Ellenőrizzük a fastq fájlok minőségét és eltávolítjuk az adaptereket.
- Igazítjuk az olvasatokat a referenciához, és ellenőrizzük a betegséggel gyanúsított gén lefedettségét.
- Ha a lefedettség egy fontos exonban a meghatározott küszöb alá esik, fontolóra vesszük egy kiegészítő Sanger ellenőrzést.
- A detektált variánsokat annotáljuk, és összehasonlítjuk adatbázisokkal (ClinVar, gnomAD) és a szakirodalommal.
Variánsok értelmezése
Az értelmezés kulcsfontosságú klinikai lépés. A talált variáns nem feltétlenül okozza a betegséget — sok variáns benignus.
A variánsok megítélésének szempontjai:
- Gyakoriság a populációban: a ritka variánsok nagyobb valószínűséggel patogének.
- Előre jelzett hatás a fehérjére: a nonsense, frameshift és a splicingot befolyásoló változások magasabb prioritást élveznek.
- Kapcsolódó szakirodalom és adatbázisok: a korábban leírt patogén variánsok erősítik a bizonyítékot.
- Családi szegregáció: az a variáns, amely a betegség családon belüli előfordulását követi, erősíti az ok-okozati összefüggést.
- Konzisztencia a gén mechanizmusával: hogy a variáns típusa összhangban van-e az ismert betegséggel az adott mechanizmus alapján.
Definíció: VUS (bizonytalan jelentőségű variáns) olyan variáns, amelyre nincs elegendő bizonyíték sem patogén, sem benignus bes
Zaregistruj se pro celé shrnutíAlready have an account? Sign in
NGS interpretáció
Klíčové pojmy: Sanger vhodný pro cílené krátké sekvence, NGS vhodné pro paralelní analýzu mnoha genů, Kontrola kvality je první krok u NGS dat, Pokrytí zvyšuje jistotu volání variant, Volání variant zahrnuje SNV, malé indely a při nastavení i CNV, Anotace doplňuje frekvenci, gen a dopad na protein, VUS neslouží jako jediný podklad pro zásadní klinická rozhodnutí, Negativní NGS výsledek neznamená automatické vyloučení genetické příčiny, Některé typy variant mohou uniknout standardnímu NGS, Rodinná segregace a funkční testy pomáhají při překlasifikaci VUS