# Hibridación in situ ## Introducción La **hibridación in situ** es un conjunto de técnicas que permiten localizar secuencias de ADN dentro de cromosomas o tejidos preservando su disposición espacial. Dos variantes frecuentes son la hibridación in situ fluorescente (**FISH**) y la hibridación genómica comparativa (**CGH** o aCGH), útiles en diagnóstico genético y en investigación oncológica. > **Definición:** La hibridación in situ es una técnica que utiliza fragmentos de ADN complementario marcados para detectar y localizar secuencias específicas en preparaciones celulares o tisulares. ## Partes fundamentales y pasos generales ### 1. Preparación de la muestra - Tipo de muestra: extensiones cromosómicas (metafase) o preparaciones en interfase, y también tejidos fijados. - Objetivo: conservar la integridad cromosómica y permitir acceso del reactivo a la molécula diana. ### 2. Desnaturalización - Se separan las dos hebras del ADN diana incrementando la temperatura o usando agentes químicos para que la sonda pueda hibridar. ### 3. Hibridación - La sonda marcada se aplica sobre la preparación y se le permite emparejarse con su secuencia complementaria. ### 4. Lavados y visualización - Se eliminan hibridaciones no específicas mediante lavados stringentes. - Visualización por microscopía de fluorescencia (en FISH) o mediante lectura con software en CGH/aCGH. > **Definición:** En FISH, las sondas están marcadas con fluorocromos para permitir observar la localización sobre cromosomas usando un microscopio de fluorescencia. ## FISH: Hibridación in situ fluorescente ### Objetivo Localizar regiones cromosómicas específicas relacionadas con alteraciones genéticas (deleciones, duplicaciones parciales, presencia de genes, translocaciones si se usan sondas apropiadas para puntos de ruptura). ### Procedimiento resumido 1. Preparar extensión cromosómica sobre portaobjetos (metafase o interfase). 2. Desnaturalizar el ADN diana aplicando calor. 3. Aplicar la sonda marcada con fluorocromo y permitir la hibridación. 4. Contratinción (ej. DAPI) para localizar cromosomas y observar las señales fluorescentes en el microscopio. ### Aplicaciones prácticas - Detección de aneuploidías en citogenética clínica (por ejemplo, cromosoma X, 21). - Identificación de microdeleciones conocidas. - Seguimiento de reordenamientos en leucemias usando sondas de ruptura o de fusión. Did you know que en FISH se pueden usar distintos colores de fluorocromos para marcar varias sondas simultáneamente y detectar varias regiones en la misma muestra? ## CGH (Hibridación genómica comparativa) y aCGH ### Qué mide La CGH detecta ganancias (duplicaciones/amplificaciones) y pérdidas (deleciones) del número de copias de secuencias a lo largo de todo el genoma comparando ADN del paciente frente a ADN control. > **Definición:** La hibridación genómica comparativa compara directamente el número de copias de ADN de una muestra frente a un control marcado con diferentes fluorocromos. ### Procedimiento resumido 1. Extraer ADN del paciente y de un control sano; marcar cada muestra con un fluorocromo distinto. 2. Desnaturalizar ambas muestras. 3. Hibridar simultáneamente las dos muestras sobre un soporte (extensiones cromosómicas para CGH clásico o microarrays para aCGH). 4. Analizar señales por microscopía y/o software que calcule la relación entre ambas señales y detecte ganancias o pérdidas. ### Limitaciones importantes - No detecta rearrangements donde no hay cambio en el número de copias (p. ej. translocaciones balanceadas). - Requiere buen control de calidad del ADN; procesos complejos pueden reducir reproducibilidad. ### aCGH (microarrays) - En lugar de extensiones cromosómicas, se usan sondas oligonucleotídicas distribuidas en un microarray que permiten mapear con alta resolución las variaciones de número de copias a lo largo del genoma. - Recomendado para análisis de tumores sólidos y diagnóstico de síndromes con microdeleciones/microduplicaciones. Fun fact: E