Resumen de Cinética Enzimática: Curva de Progreso y Práctica

## Introducción La **curva de progreso enzimática** es una representación gráfica que muestra cómo avanza una reacción catalizada por una enzima a lo largo del tiempo, registrando la cantidad de producto formado o sustrato consumido en distintos instantes. En este material nos enfocaremos en los conceptos prácticos y experimentales para diseñar y analizar una curva de progreso, usando como ejemplo la liberación de fosfato inorgánico (Pi) en una reacción catalizada por una fosfatasa alcalina (FA). > **Definición:** Una curva de progreso es el gráfico de cantidad de producto (o sustrato restante) frente al tiempo, usado para determinar velocidades iniciales y fases cinéticas de una reacción enzimática. ## Conceptos clave desglosados ### ¿Qué información proporciona una curva de progreso? - La **velocidad inicial** de la reacción, medida en la fase lineal temprana. - La transición entre la fase **lineal** (poca acumulación de producto) y la **desaceleración** (limitación por sustrato, producto o inactivación enzimática). - Efectos de condiciones experimentales: pH, temperatura, concentración de sustrato y enzima, presencia de inhibidores o activadores. ### Componentes esenciales de un experimento para curvas de progreso 1. Preparación de la mezcla de reacción (enzima + sustrato + buffer/cofactores). 2. Parada de la reacción en tiempos predeterminados mediante un agente que detiene la actividad enzimática (en este caso, molibdato de amonio). 3. Cuantificación del producto formado con una técnica colorimétrica (desarrollo de color por reducción del complejo fosfomolíbdico). 4. Construcción del gráfico: cantidad de producto vs. tiempo. > **Definición:** Velocidad inicial: la pendiente de la curva de progreso en la porción lineal más temprana, que refleja la actividad instantánea de la enzima bajo esas condiciones. ### Diseño experimental — elementos y su función - **Enzima FA**: fuente de actividad enzimática. Se trabaja con una solución concentrada y se realizan diluciones para obtener actividades medibles. - **β-glicerol-fosfato (β-glicerol P)**: sustrato a 100 mM. - **Buffer de reacción (Glicina 0.1 M + MgCl2 10 mM)**: mantiene pH y aporta cofactor Mg2+. - **Molibdato de amonio**: detiene la reacción formando un complejo con Pi. - **Solución reductora**: reduce el complejo ácido fosfomolíbdico para generar color medible. - **Solución estándar de Pi (1 mM)**: tubo patrón para construir curva estándar y convertir absorbancias a nmoles de Pi. - **Equipamiento**: espectrofotómetro, micropipetas, vortex, baño termorregulado, cronómetro, tubos, cubetas. ### Procedimiento general (resumido) 1. Preparar mezcla de reacción con volumen y concentraciones definidas. 2. Incubar a temperatura controlada; iniciar reacción con adición de enzima o sustrato. 3. A intervalos temporales predeterminados, extraer alícuotas y detener reacción con molibdato. 4. Añadir reactivo reductor para desarrollar color. 5. Medir absorbancia en espectrofotómetro y convertir a cantidad de Pi mediante la curva estándar. ## Análisis de datos ### Construcción de la curva - Eje x: tiempo (s o min). - Eje y: cantidad de producto (nmoles de Pi) o absorbancia convertida a nmoles. ### Cálculo de velocidad inicial - Seleccionar los primeros puntos que muestren relación lineal. - Ajustar una recta por regresión lineal; la pendiente es la velocidad inicial $v_0$ en nmol/min o unidades correspondientes. > **Definición:** Curva estándar: serie de soluciones de Pi con concentraciones conocidas usadas para correlacionar absorbancia con nmoles de Pi. ### Interpretación de fases - Fase lineal: la enzima trabaja sin limitación apreciable, ideal para medir $v_0$. - Desaceleración: puede indicar agotamiento de sustrato, inhibición por producto, desnaturalización o cambio en condiciones. ## Ejemplo práctico (conceptual) Supongamos que se tomaron medidas de Pi liberado cada 30 s durante 5 min y se obtuvieron los siguientes valores de nmoles: $