Zhrnutie na Laboratórne metódy vyšetrenia imunity

## Komplementový systém a imunitné testy ### Úvod Komplementový systém je súčasťou nešpecifickej humorálnej imunity, ktorá podporuje elimináciu patogénov, imunokomplexov a poškodených buniek. Laboratórne testy komplementu pomáhajú diagnostikovať choroby spojené s jeho zmenami (znížená alebo zvýšená aktivita) a identifikovať vrodené defekty zložiek komplementu. > Definícia: Komplementový systém je súbor plazmatických bielkovín, ktoré sa aktivujú kaskádovito a vedú k opsonizácii, zápalu a lýze cieľových buniek. ## Rozdelenie tém 1. Indikácie vyšetrenia komplementu 2. Metódy stanovenia zložiek komplementu 3. Meranie funkčnej aktivity: CH50 a AH50 4. Stanovenie lyzozýmu 5. Praktické príklady a aplikácie ### 1) Indikácie vyšetrenia komplementu - podozrenie na ochorenia s tvorbou imunokomplexov (napr. systémový lupus erythematosus – SLE, sérová choroba, subakútna bakteriálna endokarditída) kde dochádza k zníženiu hladín komplementu - membránoproliferatívna glomerulonefritída - choroby pečene (syntetická porucha proteínov komplementu) - ochorenia spojené s vrodenými defektmi komplementových zložiek (napr. hereditárny angioneurotický edém – HANE) - akútne zápalové stavy > Poznámka: Deficit komplementu môže byť primárny (vrodený) alebo sekundárny (spotreba pri chorobe alebo znížená syntéza). ### 2) Metódy stanovenia zložiek komplementu #### Základný princíp imunochemických metód Roztok antigénu (Ag) a protilátky (Ab) tvorí komplexy, ktoré spôsobujú zákal. Množstvo zákalu meráme turbidimetricky alebo nefelometricky. - Turbidimetria: meria intenzitu svetla, ktoré prechádza priamo cez roztok (spektrofotometria). - Nefelometria: meria intenzitu rozptýleného svetla; detektory umiestnené pri uhloch 45° a 90°. ##### Používané metódy a čo merajú | Metóda | Meraná zložka / poznámka | |---|---| | Radiálna imunodifúzia | všetky zložky a faktory C (okrem faktora D, ktorý býva nízky v sére) — precipitačná metóda | | Nefelometria | stanovenie C3, C4, D | | RIA, prietoková cytometria | stanovenie fragmentov C3a, C4a, C5a | | ELISA | stanovenie mannózviažuceho lektínu (MBL) | > Tip: Pri nefelometrii sú detektory umiestnené tak, aby zachytili rozptýlené svetlo, čo zvyšuje citlivosť pri nízkych koncentráciách. ### 3) Meranie funkčnej aktivity komplementu #### Aktivácia klasickou cestou — radiálna hemolýza **Princíp:** Komplement sa aktivuje hemolytickým systémom (HS) pozostávajúcim z ovčích erytrocytov (OERY) opsonizovaných protilátkou (amboceptor – Am). Aktivovaný komplement spôsobí lýzu OERY-Am; rozsah lýzy závisí na množstve funkčného komplementu. #### CH50 — hemolytická jednotka 50 - CH50 je množstvo séra, ktoré spôsobí lýzu 50 % OERY-Am. - Vzorky sa riedia v sérii riedení a spektrofotometricky sa stanoví hemolýza. - Z výsledkov sa vypočíta množstvo komplementu v hemolytických jednotkách. - Referenčná hodnota: $37{,}5 \pm 4$ CH50/ml #### Alternatívna cesta — AH50 - AH50 je množstvo komplementu, ktoré spôsobí lýzu 50 % králičích alebo morčacích erytrocytov za štandardných podmienok. - Referenčná hodnota: $16\text{–}22$ AH50/ml > Poznámka: Rozdiel medzi CH50 a AH50 je v spúšťacej aktivácii: klasická cesta vyžaduje Ag+Ab, alternatívna cesta sa môže aktivovať priamo na mikroorganizmoch bez protilátok. ### 4) Stanovenie lyzozýmu **Princíp:** Lyzozým degraduje bunkové steny niektorých baktérií, čím sa znižuje zákal bakteriálnej suspenzie; pokles zákalu je úmerný množstvu lyzozýmu vo vzorke. - Meranie je fotometrické (spektrofotometria) s použitím kalibračnej krivky. - Vzorky sa štandardizujú na substráte baktérií Micrococcus lysodeikticus. - Priemerné hodnoty lyzozýmu v sére: $17{,}9 \pm 3{,}9$ mg/l. ### 5) Praktické príklady a klinické aplikácie - SLE: často nájdete znížené hladiny C3 a C4 a znížený CH50 v dôsledku spotreby komplementu pri imunokomplexom sprostredkovanom poškodení. - Membránoproliferatívna glomerulonefritída: znížené hladiny niektorých komplementových komponentov, indikujúce aktívny zápal v glomerule. - HANE (hereditár