Fagocytóza: Mechanizmy, testy a poruchy

Fagocytóza je kľúčový obranný mechanizmus vrodenej imunity, pri ktorom špecializované bunky pohlcujú a ničia cudzorodé častice vrátane patogénnych mikroorganizmov. Pochopenie fagocytózy: mechanizmy, testy a poruchy je nevyhnutné pre študentov biológie, medicíny a veterinárnej medicíny. V tomto článku sa pozrieme na základné mechanizmy, podrobne preberieme diagnostické testy a predstavíme najznámejšie vrodené aj získané poruchy. Získajte komplexný prehľad o tejto fascinujúcej imunitnej funkcii.

Čo je fagocytóza a jej základné mechanizmy

Fagocytóza je zložitý proces, pri ktorom profesionálne fagocyty – neutrofily, monocyty a tkanivové makrofágy – pohlcujú, inaktivujú (usmrcujú) a rozkladajú rôzne častice. Medzi tieto častice patria patogénne mikroorganizmy, ako aj iné cudzorodé látky. Tento proces je základom nešpecifickej imunity a pozostáva z niekoľkých na seba nadväzujúcich medzistupňov:

1. Migrácia fagocytov do miesta zápalu: Fagocyty sú lákané chemotaktickými faktormi. Endogénne faktory zahŕňajú fragmenty fibrínu, kolagénu, štiepne produkty komplementu (napr. C5a) a cytokíny (napr. IL-8, PAF). Exogénne faktory sú komponenty bakteriálnych buniek, ako N-formylovaný metionín alebo endotoxín. Aktivované neutrofily následne exprimujú adhezívne molekuly (CAM) na svojom povrchu.
2. Adherencia častice na povrch fagocytu: Častica sa pripojí k fagocytu, často s pomocou opsonínov, ktoré uľahčujú rozpoznanie.
3. Pohltenie (ingescia) cudzorodých častíc: Fagocyt obklopí časticu a pohltí ju do svojho vnútra, čím vznikne fagozóm.
4. Deštrukcia pohltnutého materiálu: Vo vnútri fagocytu dochádza k usmrteniu a rozkladu častice prostredníctvom rôznych mechanizmov.

Nedostatočná funkcia fagocytov vedie k zvýšenej náchylnosti k bakteriálnym infekciám, najmä kože, respiračného a gastrointestinálneho traktu. Takéto infekcie sú často ťažko liečiteľné antibiotikami. Deficity fagocytózy môžu byť primárne (vrodené) alebo sekundárne (získané).

Hodnotenie ingescie fagocytov: Testovanie pohltenia

Na in vitro testovanie schopnosti fagocytov pohlcovať častice sa používajú rôzne metódy a materiály. Táto sekcia sa zameriava na to, ako určiť fagocytárnu aktivitu a index fagocytárnej aktivity.

Klasická metóda hodnotenia ingescie

Jednou z najjednoduchších metód je testovanie ingescie opsonizovaných partikúl. Na tento test sa môžu použiť rôzne častice, ako sú latexové alebo metakrylátové hydrofilné častice (MSHP), zymozán alebo usmrtené mikroorganizmy ako napríklad Candida albicans. Hoci tieto častice aktivujú komplement, ich opsonizácia fragmentom C3b nie je vždy najdôležitejšou podmienkou pre fagocytózu.

Postup:

1. Zmieša sa 150 µl krvi (s 10 m.j.ml⁻¹ heparínu) s 50 µl suspenzie C. albicans (koncentrácia 1 – 2 x 10⁷ v 50 µl).
2. Vzorka sa inkubuje 60 minút pri 37 °C, pričom sa premiešava každých 10 minút.
3. Zo vzorky sa pripravia krvné nátery, ktoré sa zafarbia podľa Pappenheima (napr. farbiace roztoky May-Grünwald a Giemsa-Romanovsky).

Hodnotenie výsledku: Pomocou mikroskopu sa hodnotí ingescia v 100 potenciálne fagocytujúcich leukocytoch (neutrofilov a monocytov):

• Spočítajú sa bunky, v ktorých je pohltená jedna a viac kandíd, resp. tri a viac MSHP častíc.
• Spočíta sa celkový počet pohltených častíc v týchto fagocytoch.

Na základe získaných údajov sa stanoví:

• Fagocytová aktivita (FA): $$ FA \ (%) = \frac{\text{Počet fagocytov s pohltanými časticami}}{\text{Celkový počet počítaných fagocytov}} \times 100 $$PMNL by mala byť približne 75-85 %.
• Index fagocytovej aktivity (IFA): $$ IFA = \frac{\text{Počet pohltaných C. albicans v 100 fagocytoch}}{100} $$IFA (priemerný počet častíc v jednej bunke) by mal byť približne 3-4.

Znížené hodnoty FA a IFA sa pozorujú u pacientov s primárnou imunodeficienciou fagocytózy, sepsou, rekurentnými bakteriálnymi infekciami a v terminálnom štádiu nádorových ochorení.

Prietoková cytometria pre presnejšie hodnotenie ingescie

Klasické mikroskopické vyhodnocovanie je náročné a limitované malým počtom hodnotených leukocytov. Tieto nevýhody odstraňuje testovanie ingescie pomocou prietokovej cytometrie s fluoresceínom značenými E. coli.

Na tomto princípe je založený napríklad Phagotest™. Je oveľa rýchlejší, ľahšie vykonateľný, citlivejší a spoľahlivejší v porovnaní s klasickým testom. Umožňuje tiež nezávisle vyhodnotiť fagocytózu neutrofilov alebo monocytov.

Hodnotenie metabolického (respiračného) vzplanutia

Aktivované fagocyty usmrcujú pohltnuté mikroorganizmy prostredníctvom rôznych antimikrobiálnych mechanizmov. Jedným z kľúčových je respiračné vzplanutie, pri ktorom sa po ingescii mikroorganizmov výrazne zvyšuje spotreba kyslíka.

Počas respiračného vzplanutia sa vytvára voľný superoxidový anión (•O₂⁻) a následne ďalšie reaktívne kyslíkové medziprodukty (ROI), ako sú peroxid vodíka (H₂O₂), hydroxylové radikály (OH⁻) a singletový kyslík. Tieto produkty sú kľúčové pre usmrtenie baktérií.

Kroky respiračného vzplanutia: $$ \mathrm{NADPH} + 2\mathrm{O}_2 \xrightarrow{\mathrm{NADPH} \text{ oxidáza (NOX)}} 2^\text{•}\mathrm{O}_2^- + \mathrm{NADP}^+ + \mathrm{H}^+ $$ $$ \text{•}\mathrm{O}_2^- + \text{•}\mathrm{O}_2^- + 2\mathrm{H}^+ \xrightarrow{\text{Superoxid dizmutáza}} \mathrm{H}_2\mathrm{O}_2 + \mathrm{O}_2 $$ $$ \mathrm{H}_2\mathrm{O}_2 + \mathrm{Cl}^- \xrightarrow{\text{Myeloperoxidáza}} \mathrm{H}_2\mathrm{O} + \mathrm{ClO}^- $$

Kvantitatívne testy produkcie kyslíkových radikálov

Na hodnotenie produkcie kyslíkových radikálov sa používajú spektrofotometrické alebo prietokovo-cytometrické testy. Najpoužívanejším kolorimetrickým testom je jodnitrotetrazólium (INT) test alebo jeho analógy MTT či XTT.

Princíp INT testu: Izolované PMNL sa inkubujú s časticami (napr. škrobovými alebo zymozánom), ktoré stimulujú respiračné vzplanutie, v prostredí tetrazóliových solí. Tetrazóliové soli prenikajú do buniek a v aktivovaných fagocytoch sú redukované na nerozpustný fialový formazán. Množstvo formazánu nepriamo odráža metabolickú aktivitu testovaných PMNL.

Alternatívne sa používajú difúzne aktivátory ako forbolmyristát-acetát (PMA), ktorý priamo indukuje respiračné vzplanutie aktiváciou proteínkinázy C.

Postup INT testu:

1. Z 10 ml krvi sa izolujú leukocyty (koncentrácia 1 x 10⁷ buniek.ml⁻¹).
2. Pripravia sa dve skúmavky: „spontánna“ tetrazóliumreduktázová aktivita (negatívna kontrola) a aktivita buniek pri fagocytóze (pozitívna vzorka). Do nich sa pridajú zložky ako Hanksov roztok, bunková suspenzia, škrob alebo FFR a INT roztok.
3. Vzorky sa inkubujú 45 minút pri 37 °C (premiešavanie každých 10 minút).
4. Reakcia sa zastaví pridaním 1 ml 1 mol.l⁻¹ HCl.
5. Vzorky sa centrifugujú, supernatant sa vyleje a k sedimentu sa pridá 3 ml metanolu na extrakciu formazánu.
6. Po premiešaní a inkubácii sa vzorky opäť centrifugujú.
7. Absorbancia vzoriek sa hodnotí spektrofotometrom pri A₄₆₅.

Hodnotenie IMA (Index metabolickej aktivity): $$ \text{IMA} = \frac{\text{Absorbancia stimulovaných buniek (+)}}{\text{Absorbancia negatívnej kontroly (-)}} $$ Index metabolickej aktivity fagocytujúcich leukocytov by mal byť číslo ≥ 2.

Prietoková cytometria pre respiračné vzplanutie

Prietoková cytometria sa tiež využíva na stanovenie mechanizmov intracelulárneho usmrcovania buniek závislých od kyslíka. Fagocytujúce bunky sú stimulované neznačenými baktériami (E.coli) alebo forbolovými estermi a inkubované s dihydrorodamínom 123 (DHR). DHR je oxidovaný peroxidom vodíka na rodámin 123, ktorý po excitácii emituje červený fluorescenčný signál. Ten sa deteguje v prietokovom cytometri na stanovenie podielu buniek produkujúcich kyslíkové radikály. Na tomto princípe sú založené testy ako PHAGOBURST® alebo FagoFlow™ test.

Meranie chemiluminiscenčnej (CL) aktivity

Ďalšou možnosťou hodnotenia metabolickej aktivácie a produkcie ROI je meranie chemiluminiscencie (CL). Peroxid vodíka, produkovaný počas respiračného vzplanutia, slúži ako substrát pre produkciu HClO a ClO⁻ katalyzovanú myeloperoxidázou. Po inkubácii PMNL so stimulátorom (napr. forbolovými estermi) a luminolom pri 37 °C sa hodnotí chemiluminiscencia. Tento test sa môže použiť na diagnostiku chronickej granulomatóznej choroby, ale aj na zistenie nedostatku myeloperoxidázy, pretože chemiluminiscencia závisí od NADPH oxidázy a myeloperoxidázy. Pacient, ktorého PMNL reagujú na stimuláciu forbolovým esterom, ale nie na opsonizované častice, má pravdepodobne poruchu ingescie. Naopak, PMNL od pacienta s primárnou poruchou schopnosti generovať respiračné vzplanutie nebudú reagovať na žiadny podnet.

Hodnotenie mikrobicídnej aktivity fagocytov: Testy usmrcovania

Hlavnou úlohou profesionálnych fagocytov je zabíjanie mikróbov po ich pohltení. Túto schopnosť možno in vitro testovať pomocou rôznych živých mikroorganizmov (C. albicans, S. aureus alebo E. coli).

Klasická metóda hodnotenia mikrobicídnej aktivity:

1. Po jednohodinovej inkubácii vzorky krvi s mikroorganizmami (napr. C. albicans) sa krvné bunky lyzujú deoxycholátom sodným.
2. Uvoľnené C. albicans sa zafarbia metylénovou modrou (na rozlíšenie mŕtvych a živých, keďže farbivo neprechádza do živých buniek).
3. Pripraví sa mikroskopický náter a pod mikroskopom sa spočíta počet mŕtvych kandidátov zo všetkých počítaných (zvyčajne 400).
4. Cídna aktivita (% cídie) sa vypočíta pomocou vzorca: $$ % \text{ cídie} = \frac{\text{Počet mŕtvych C. albicans vo vzorke} - \text{počet mŕtvych C. albicans v kontrole}}{\text{Celkový počet počítaných C. albicans}} \times 100 $$

Percento cídnej aktivity pod 25 % indikuje možný defekt v jednom alebo viacerých mikrobicídnych mechanizmoch.

Alternatívna metóda s agarovou platňou: Antimikrobiálna aktivita sa môže stanoviť aj inokuláciou suspenzie C. albicans zo vzoriek a kontrolných skúmaviek na Sabouraudov agar. Po inkubácii platní (48 hodín pri 37 °C) sa spočítajú porastené kolónie. Cídna aktivita (% cídie) sa vypočíta takto: $$ % \text{ cídie} = \frac{\text{Počet porastených kolónií C. albicans vo vzorke}}{\text{Počet porastených kolónií C. albicans v kontrole}} \times 100 $$ Tieto testy sú však pracné a časovo náročné.

Alternatívou kvantitatívneho hodnotenia mikrobicídnej aktivity PMNL sú testy hodnotiace počet živých a mŕtvych baktérií pomocou prietokového cytometra.

Poruchy fagocytózy: Vrodené a získané deficity

Poruchy fagocytózy vedú k závažným zdravotným problémom, najmä k rekurentným pyogénnym infekciám. Môžu byť vrodené alebo získané. Charakteristika porúch fagocytózy je kľúčová pre správnu diagnostiku a liečbu.

Vrodené (primárne) poruchy fagocytózy

Vrodené abnormality sú dobre známe u ľudí, u zvierat boli opísané iba niektoré z nich:

• BLAD (Bovine Leukocyte Adhesion Deficiency): Najznámejšia autozomálne recesívna porucha fagocytózy u plemena Holstein, spojená s deficitom adhezívnej molekuly – integrínu CD18. Mutácia v géne pre CD18 spôsobuje, že neutrofily nie sú schopné adherovať na endotelové bunky a migrovať do extravaskulárneho priestoru. Postihnuté zvieratá trpia rekurentnými bakteriálnymi infekciami, anorexiou, gingivitídami, periodontitídami, chronickými pneumóniami, spomaleným rastom a zlým hojením rán, sprevádzanými perzistentnou extrémne vysokou leukocytózou s neutrofíliou. Diagnostika je možná pomocou PCR.
• CLAD (Canine Leukocyte Adhesion Deficiency): Rovnaké ochorenie ako BLAD, vyskytuje sa u psov a je spôsobené neschopnosťou leukocytov exprimovať integrín CD11b/CD18. Vedie k podobným problémom ako BLAD a dá sa diagnostikovať pomocou PCR.
• Chédiakov-Higashiho syndróm: Autozomálne recesívne ochorenie zaznamenané u dobytka, psov, mačiek, tigrov, noriek a myší. Typická je prítomnosť abnormálne veľkých granúl vo vnútri neutrofilov, monocytov a eozinofilov, ktoré vznikajú ich fúziou. Tieto granuly spontánne rupturujú, čo spôsobuje poškodenie tkaniva, napr. katarakty v očiach.
• Chronická granulomatózna choroba (CGD): Vrodené ochorenie u ľudí, spojené s neschopnosťou neutrofilov a monocytov usmrcovať pohltené baktérie následkom poruchy tvorby NADPH oxidázového (NOX) komplexu. Postihnutí jedinci trpia recidivujúcimi infekciami spôsobenými katalázovo pozitívnymi baktériami a plesňami (pneumónie, abscesy kože a orgánov, kožné infekcie, osteomyelitídy). U zvierat sa toto ochorenie doposiaľ nezistilo.

Primárne deficity môžu byť spôsobené aj inými príčinami, ako je porucha mobilizácie leukocytov z kostnej drene, strata receptorov pre chemotaktické faktory, strata adhezívnych molekúl alebo neschopnosť tvorby baktericídnych zložiek.

Získané (sekundárne) poruchy fagocytózy

Získané deficity fagocytózy môžu byť vyvolané rôznymi faktormi:

• Fyziologické faktory: Mláďatá a staré jedince majú často zníženú fagocytárnu funkciu.
• Infekcie: Vírusové infekcie ako vírus leukémie mačiek (FeLV), vírus panleukopénie mačiek (FPVC), vírus imunodeficiencie mačiek (FIV), vírus imunodeficiencie hovädzieho dobytka (BIV) a cirkovírusová infekcia ošípaných (PCV2) môžu narušiť funkciu fagocytov.
• Toxíny: Enviromentálne toxíny a mykotoxíny.
• Podvýživa: Nedostatok mikroprvkov (zinok, meď, selén, železo), vitamínov A a E, ale aj obezita.
• Stres: Nadmerná záťaž, transport alebo trauma.
• Lieky: Kortikosteroidy, sulfonamidy, lieky na liečbu nádorov.
• Myeloproliferatívne ochorenia.

Aj tieto získané deficity fagocytózy sú sprevádzané vznikom ťažko liečiteľných sekundárnych infekcií.

FAQ: Fagocytóza otázky a odpovede pre študentov

Aké sú hlavné typy profesionálnych fagocytov?

Hlavnými typmi profesionálnych fagocytov sú neutrofily, monocyty a tkanivové makrofágy. Tieto bunky sú kľúčové pre proces pohlcovania a ničenia cudzích častíc, ako sú baktérie, vírusy a bunkové úlomky.

Ako sa hodnotí ingestia fagocytov v laboratóriu?

Ingestia fagocytov sa hodnotí in vitro metódami, ako je mikroskopické počítanie pohltených častíc (napr. Candida albicans) v 100 leukocytoch, z čoho sa vypočíta fagocytová aktivita (FA) a index fagocytovej aktivity (IFA). Moderné laboratóriá využívajú aj prietokovú cytometriu s fluoresceínom značenými baktériami pre rýchlejšie a presnejšie výsledky, napr. Phagotest™.

Čo je to respiračné vzplanutie a prečo je dôležité?

Respiračné vzplanutie je metabolický proces, pri ktorom aktivované fagocyty dramaticky zvyšujú spotrebu kyslíka na produkciu reaktívnych kyslíkových medziproduktov (ROI), ako sú superoxidový anión a peroxid vodíka. Tieto ROI sú silne antimikrobiálne a sú nevyhnutné pre efektívne usmrcovanie pohltených mikroorganizmov.

Aké sú hlavné vrodené poruchy fagocytózy u zvierat?

U zvierat sú známe vrodené poruchy fagocytózy ako BLAD (Bovine Leukocyte Adhesion Deficiency) u dobytka a CLAD (Canine Leukocyte Adhesion Deficiency) u psov, ktoré sú spojené s defektom adhezívnych molekúl. Ďalej je to Chédiakov-Higashiho syndróm, ktorý postihuje rôzne druhy a vyznačuje sa abnormálne veľkými granulami vo fagocytoch.

Aké faktory môžu viesť k získanej poruche fagocytózy?

Získané deficity fagocytózy môžu byť spôsobené viacerými faktormi, vrátane vírusových infekcií (napr. FeLV, FIV), pôsobenia toxínov (vrátane mykotoxínov), podvýživy (nedostatok mikroprvkov alebo vitamínov, obezita), chronického stresu, užívania niektorých liekov (kortikosteroidy) a myeloproliferatívnych ochorení.