Resumen de Principios y Técnicas de Laboratorio Clínico
Principios y Técnicas de Laboratorio Clínico: Guía Completa
Introducción
La citometría de flujo es una técnica cuantitativa que permite analizar características físicas y químicas de células individuales en suspensión mediante la intersección de un rayo de luz y detectores electrónicos. En este material repasaremos los componentes fundamentales del citómetro, las técnicas de preparación de muestras, principios ópticos y de detección, visualización de datos y métodos de separación celular, con ejemplos prácticos y aplicaciones experimentales.
Definición: La citometría de flujo es una técnica que analiza células individuales en suspensión midiendo luz dispersada y fluorescencia para cuantificar características físicas y moleculares.
1. Componentes fundamentales del citómetro
1.1 Sistema de inyección y control del flujo
- Sistemas comunes: presión diferencial o sistema volumétrico (bomba de jeringa).
- El sistema volumétrico utiliza una jeringa con velocidad calibrada para controlar el volumen inyectado con precisión.
Definición: Sistema volumétrico, mecanismo que impulsa la muestra mediante una bomba de jeringa calibrada para controlar el paso celular.
Tabla comparativa: Sistema por presión vs sistema volumétrico
| Característica | Presión diferencial | Sistema volumétrico |
|---|---|---|
| Control de caudal | Rápido, menos preciso | Muy preciso, más lento |
| Mantenimiento | Menor complejidad | Lavado más complicado |
| Aplicaciones típicas | Alto rendimiento | Ensayos con necesidad de volumen exacto |
1.2 Cámara de flujo
- La cámara genera flujo laminar que alinea las células en un hilo central de suspensión envolvente.
- Tipos: cámaras abiertas (boquilla cónica) y cámaras cerradas (tubo confinado).
Tabla: Cámaras abiertas vs cerradas
| Aspecto | Cámaras abiertas | Cámaras cerradas |
|---|---|---|
| Orificio | 50-100 µm | 50-100 µm (salida) |
| Bioseguridad | Menor | Mayor |
| Mantenimiento | Más | Menos |
| Riesgo de aerosol | Sí | No |
- El flujo laminar se regula por la diferencia de presión entre líquido envolvente y muestra; mayor presión envolvente disminuye el volumen de muestra y viceversa.
Definición: Flujo laminar, régimen de flujo en el que capas de fluido se deslizan sin mezcla turbulenta, esencial para el alineamiento celular en citometría.
1.3 Fuentes de luz
- Láseres comunes: argón 488 nm, helio-neón 633 nm, kriptón 657 nm y diodos de estado sólido en longitudes 355, 405, 488, 530, 549, 635, 780 nm.
- Ventajas del láser: alta intensidad, monocromaticidad y coherencia, necesarias para excitar fluorocromos con precisión.
Definición: Fluorocromo, molécula que absorbe luz a cierta longitud de onda y emite fluorescencia en otra longitud para su detección.
1.4 Sistema óptico y detectores
- Elementos ópticos: lentes, espejos dicroicos, filtros (cut-on/cut-off) que encaminan señales a detectores.
- Detectores: fotomultiplicadores (PMT) para señales débiles y fotodiodos para señales fuertes.
Definición: Fotomultiplicador, detector sensible que convierte fotones en pulsos eléctricos amplificados.
1.5 Sistema informático
- Procesamiento de pulso a partir del detector: transformación a histogramas, diagramas de dispersión y análisis multidimensional.
- Permite establecer regiones (gates), calcular estadísticas y generar informes.
2. Señal y relación fluorescencia-señal
- La fluorescencia emitida es proporcional a la cantidad de fluorocromo ligado a la célula; por tanto, a la cantidad de moléculas objetivo.
$$ ext{Señal} \propto \text{Número de moléculas marcadas}$$
- Fluorocromos dobles (tándem) como PE-Cy5 y PE-Cy7 aumentan parámetros medibles con una sola excitación.
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Citometría Esencial
Klíčové pojmy: La cámara de flujo genera flujo laminar que alinea células individuales., El sistema volumétrico permite control preciso del volumen inyectado mediante jeringa., Láseres proporcionan excitación monocromática; longitudes comunes: 355,405,488,530,549,635,780 nm., PMT y fotodiodos convierten la fluorescencia en pulsos eléctricos proporcionales., Fluorocromo unido a marcador permite cuantificar número de moléculas por célula., Histogramas y diagramas de dispersión son representaciones clave para análisis de poblaciones., Separadores de gotitas alcanzan purezas >99% cargando y desviando gotitas., Preparación de muestra monodispersa y controles de compensación son críticos para datos fiables., Quantum dots reducen solapamiento espectral y mejoran fotoestabilidad., Análisis del ciclo celular distingue fases G0/G1, S y G2/M por contenido de ADN., Cámaras cerradas ofrecen mayor bioseguridad y menor riesgo de aerosoles., Separadores de líquido ofrecen mayor bioseguridad pero menor velocidad y pureza.