Shrnutí na Optické a instrumentální metody

## Úvod Spektrofotometrie je metoda měření interakce světla se vzorkem za účelem kvantifikace látky v roztoku. V této příručce se naučíte základy transmitance, absorbance, zákon Lambert-Beer, praktické kalibrace a běžné měřicí režimy vhodné pro nepřítomného studenta (Not attending). > **Definice:** Transmitance je podíl intenzity záření po průchodu vzorkem a intenzity záření dopadajícího na vzorek. ## Základní pojmy ### Transmitance (T) - Transmitance: $T=\dfrac{I}{I_0}$, kde $I_0$ je intenzita záření vstupujícího do vzorku a $I$ je intenzita po průchodu. - Alternativně pro korekci na pozadí: $T=\dfrac{I_v}{I_b}$, kde $I_b$ je intenzita prošlá slepým vzorkem (blank) a $I_v$ je intenzita prošlá měřeným vzorkem. - Interpretace: - $T=100\%$ znamená žádná absorpce (hodnoty $I$ a $I_0$ stejné). - $T<100\%$ znamená absorpce; $I$ je menší než $I_0$. > **Definice:** Blank (slepý vzorek) je roztok neobsahující analyt; slouží k odečtení pozadí způsobeného matricí nebo reagenciemi. ### Absorbance (A) - Absorbance je bezrozměrná veličina užívaná ve fotometrii: $A=-\log T$. - Závisí na vlnové délce $\lambda$, vlastnostech látky, délce kyvety $l$ a koncentraci $c$. > **Definice:** Absorbance je záporný dekadický logaritmus transmitance a nevyjadřuje přímo procenta, ale logaritmický úbytek intenzity světla. ## Lambert-Beerův zákon - Základní formulace: $$A=\varepsilon\times c\times l$$ - $\varepsilon$ [l\cdot mol^{-1}\cdot cm^{-1}] je molární absorpční koeficient (specifická pro látku při dané $\lambda$), - $c$ [mol\cdot l^{-1}] je látková koncentrace, - $l$ [cm] je délka kyvety. - Pro výpočet koncentrace: $$c=\dfrac{A}{\varepsilon\times l}$$ - Optimální rozsah absorbance pro citlivé měření je $0{,}2-0{,}8$. > **Praktický příklad:** Pokud $A_{275}=0{,}7$, $\varepsilon=8400\ \mathrm{l\cdot mol^{-1}\cdot cm^{-1}}$ a $l=1\ \mathrm{cm}$, pak $$c=\dfrac{0{,}7}{8400\times 1}.$$ ### Omezení platnosti L-B zákona Lambert-Beer platí jen při splnění podmínek: 1. Monochromatické záření (správně zvolená $\lambda$). 2. Nízké koncentrace analytu ($c<10^{-2}\ \mathrm{mol\cdot l^{-1}}$). 3. Jen jedna významně absorbující složka v roztoku. 4. Absorbující látka je stabilní (nepodléhá rozkladu, fotosenzitivitě apod.). 5. Žádné rozptylování nebo odrazy (bez sraženin). 6. Celý světelný svazek prochází kyvetou (pro vysoce viskózní kapaliny může být problém). 7. Kyvety jsou planparalelní, čisté a neporušené. 8. Měřená látka je čirá a nefluoreskuje. > **Zajímavost:** Věděli jste, že příliš vysoká koncentrace nebo přítomnost jemných částic (rozptýlení světla) vede k porušení Lambert-Beerova zákona a falešně nízkým hodnotám absorbance? ## Metody stanovení koncentrace v praxi ### 1) Přímá spektrofotometrie - Měření absorpčního spektra reálných vzorků, např. mozkomíšního moku pro odhalení krvácení (sledování oxyhemoglobinu, methemoglobinu, bilirubinu). - U některých analyzů lze přímo použít $\varepsilon$ k výpočtu koncentrace (vzácné v klinické praxi). ### 2) Metoda jednoho standardu (dvoubodová kalibrace) - Nejrychlejší: měří se absorbance standardu a blanku. - Standard obsahuje známou koncentraci $c_{st}$. - Výpočet: $$c_{vz}=\dfrac{A_{vz}-A_{blank}}{A_{st}-A_{blank}}\times c_{st}$$ ### 3) Metoda kalibračního faktoru - Kalibrační faktor: $$F=\dfrac{c_{st}}{A_{st}}$$ - Poté: $$c_{vz}=A_{vz}\times F$$ - Platí, pokud jsou všechny vzorky a kalibrátory připraveny stejným způsobem. ### 4) Metoda kalibrační křivky (vícebodová) - Nejpřesnější metoda: použijete minimálně 5–6 kalibrátorů pokrývajících klinický rozsah. - Sestrojíte lineární regresi: $$y=ax+b$$ kde $y$ je absorbance a $x$ koncentrace. - Z rovnice získáte koncentraci měřeného vzorku. > **Poznámka:** Hodnoty kalibrace je často nutné korelovat odečtením blanku, čímž se zvýší citlivost měření. ### Limity kalibrace - LOD = Limit of Detection (nejnižší detekovatelná koncentrace). - LOQ = Limit of Quantification (nejnižší kvantifikovatelná koncentrace s jistotou). - Dynamický rozsah = interval