La Cinètica i Quantificació Microbiana és un camp fonamental en microbiologia i biotecnologia, essencial per entendre com creixen els microorganismes i com podem mesurar-los. Aquesta guia completa explora els conceptes clau i els càlculs pràctics que tot estudiant ha de dominar per aprofundir en el creixement microbià i la seva quantificació, des de les taxes de creixement fins als mètodes de recompte. Preparat per a aprovar els teus exàmens!

Fonaments de la Cinètica Microbiana per a Estudiants

La cinètica microbiana estudia la velocitat amb què els microorganismes es multipliquen. Entendre aquests principis és crucial per a aplicacions en la indústria, la medicina i la investigació. Aquí destaquem els paràmetres més importants:

Temps de Generació (g)

El temps de generació (g), o temps de duplicació, és el temps que triga una població microbiana a doblar la seva mida. S'expressa en unitats de temps (hores, minuts).

Càlculs pràctics:
Si un cultiu té una velocitat específica de creixement (µ) de 0,01 min⁻¹, el temps de generació és de 69,3 minuts (1,155 hores).
En un cultiu on el nombre de cèl·lules passa de 10.000 a 100.000.000 en 4 hores, el temps de generació és de 0,3 hores.

Velocitat Específica de Creixement (µ)

La velocitat específica de creixement (µ) representa la taxa a la qual augmenta la biomassa o el nombre de cèl·lules per unitat de temps. S'expressa habitualment en h⁻¹ o min⁻¹.

Relació amb el temps de generació: g = ln(2) / µ o g = 0,693 / µ.
Exemples:
Si un cultiu passa de 10³ a 4000 bacteris/mL en 2 hores, la µ és de 0,693 h⁻¹.
En una fase exponencial on la biomassa va de 0,305 g/L a 5,6 g/L en 10 hores, la µ és de 0,291 h⁻¹.

Càlcul de Cèl·lules al Llarg del Temps (N)

Per predir la quantitat de cèl·lules en un moment donat, utilitzem la fórmula N = N₀ · 2ⁿ, on N₀ és la concentració inicial i n és el nombre de generacions (temps total / temps de generació).

Exemple 1: Partint de 10⁴ ufc/mL amb un temps de generació de 2 hores:
A les 4 h: 3,99 · 10⁴ ufc/mL
A les 24 h: 4,09 · 10⁷ ufc/mL
A les 48 h: 1,67 · 10¹¹ ufc/mL
Exemple 2: Si 46 cèl·lules de Propionibacterium acnes (g = 90 min, fase de latència = 1,5 h) contaminen una paella, al cap de 10 hores hi haurà 2,3 · 10³ cèl·lules.

Determinació de la Concentració Inicial (N₀) i Temps d'Incubació

Sovint necessitem calcular la concentració inicial o el temps necessari per arribar a una certa densitat.

Per arribar a 10⁸ cèl·lules/mL en 3 hores amb un g de 30 minuts, la densitat inicial ha de ser 1,56 · 10⁶ cèl·lules/mL.
Per passar de 10⁶ a 10⁸ cèl·lules/mL amb un g de 30 minuts, es necessiten 3,323 hores d'incubació.

Fases del Creixement Microbià: Anàlisi d'una Corba de Fermentació

El creixement microbià en un cultiu discontinu segueix un patró característic amb diferents fases. Analitzant dades de fermentació, podem identificar-les.

Fase de latència: Període inicial sense un augment significatiu de cèl·lules. En l'exemple de fermentació amb metanol, va ser de t=0h a t=2h.
Fase exponencial (o logarítmica): Creixement ràpid i constant. En l'exemple, entre t=4h i t=14h. Durant aquesta fase, els paràmetres són:
Velocitat específica de creixement (µ): 0,291 h⁻¹
Temps de generació (g): 2,38 h
Nombre de generacions (n): 4 generacions en 10 hores.
Fase estacionària: La taxa de creixement s'iguala a la taxa de mort. En l'exemple, comença a partir de les 14h.

Mètodes de Quantificació Microbiana: Comptar els Microorganismes

Quantificar el nombre de microorganismes és essencial per a monitoritzar cultius i realitzar investigacions.

Recompte en Placa (UFC/mL)

El mètode de les unitats formadores de colònies (UFC) és un dels més utilitzats. Es basa en dilucions seriades per obtenir plaques amb un nombre de colònies comptable.

Per què dilucions seriades? Cal fer dilucions per assegurar que s'obtenen plaques amb un nombre de colònies manejable (generalment entre 30 i 300) per a un recompte precís, evitant plaques amb un excés de creixement ('lawn').
Càlcul de UFC/mL: Es selecciona una placa amb un recompte adequat (ex: entre 30 i 300 ufc). La fórmula és: UFC/mL = (Recompte de colònies) / (Volum sembrat en mL · Factor de dilució de la placa).

Exemples de Càlculs de UFC/mL

Cultiu d'Escherichia coli LE392:

Dilucions i recomptes: 10⁻¹ (965), 10⁻² (420), 10⁻³ (110), 10⁻⁴ (12).
Plaques adequades: 10⁻³ (110 ufc). UFC/mL = 110 / (0,1 mL · 10⁻³) = 1,1 · 10⁶ ufc/mL. La 10⁻² també podria ser acceptable si es prenen mitjanes.
Per obtenir 1·10⁵ ufc/mL d'un cultiu de 1,1·10⁶ ufc/mL, cal aplicar una dilució de 1/11, és a dir, diluir 10 vegades i després un 10% més.

Cultiu de Bacillus subtilis:

Dilucions i recomptes: 10⁻¹ (1200), 10⁻² (210), 10⁻³ (33), 10⁻⁴ (5).
Plaques adequades: 10⁻² (210 ufc) i 10⁻³ (33 ufc) són les més adequades. La 10⁻¹ té massa colònies i la 10⁻⁴ massa poques.
UFC/mL (utilitzant 10⁻²): 210 / (0,1 mL · 10⁻²) = 2,1 · 10⁶ ufc/mL.
Per obtenir una placa amb 150 colònies: Necessitem una dilució que doni aproximadament 1500 ufc/mL en el tub de dilució (150 / 0.1 mL). Si el cultiu inicial és 2,1 · 10⁶ ufc/mL, cal una dilució de (1500 / (2,1 · 10⁶)) = ~7 · 10⁻⁴. Sembrar una dilució 10⁻³ o una 10⁻⁴ podria funcionar, ajustant per a 150 colònies la 10⁻³ és la que més s'acosta (33 colònies). Per obtenir 150 colònies, caldria sembrar una dilució aproximada de 10⁻³·(150/33) = ~4.5·10⁻³. És a dir, una dilució 10⁻³ amb un volum major o una dilució entre 10⁻² i 10⁻³.

Quantificació per Absorbància (Densitat Òptica)

La mesura de l'absorbància a 600 nm és un mètode ràpid per estimar la densitat cel·lular, utilitzant una corba de calibratge.

Recta de regressió: y = 7,00 · 10⁻¹⁰ · x + 0,15 (on 'y' és l'absorbància i 'x' és la concentració de cèl·lules en ufc/mL).

Exemples amb Absorbància

Concentració donada, absorbància buscada: Si la concentració és de 8 · 10⁸ ufc/mL:

Absorbància (y) = 7,00 · 10⁻¹⁰ · (8 · 10⁸) + 0,15 = 0,56 + 0,15 = 0,71.

Absorbància donada, concentració buscada: Si l'absorbància és 0,153:

0,153 = 7,00 · 10⁻¹⁰ · x + 0,15
0,003 = 7,00 · 10⁻¹⁰ · x
x = 0,003 / (7,00 · 10⁻¹⁰) = 4,28 · 10⁶ cèl·lules/mL.

Suspensió d'E.coli amb alta absorbància: Si l'absorbància és 2,1:

2,1 = 7,00 · 10⁻¹⁰ · x + 0,15
1,95 = 7,00 · 10⁻¹⁰ · x
x = 1,95 / (7,00 · 10⁻¹⁰) = 2,78 · 10⁹ ufc/mL.

Suspensió diluïda de Bacillus subtilis: Si l'absorbància de la mostra diluïda 1/10 és 0,484:

Absorbància de la mostra original = 0,484 · 10 = 4,84.
4,84 = 7,00 · 10⁻¹⁰ · x + 0,15
4,69 = 7,00 · 10⁻¹⁰ · x
x = 4,69 / (7,00 · 10⁻¹⁰) = 6,7 · 10⁹ cèl·lules/mL (densitat cel·lular de la mostra inicial).

Preguntes Freqüents sobre Cinètica i Quantificació Microbiana

Què significa el temps de generació i com es calcula?

El temps de generació (g) és el temps que triga una població microbiana a doblar-se. Es calcula dividint el logaritme natural de 2 (aproximadament 0,693) per la velocitat específica de creixement (µ). Un exemple és g = 0,693 / µ.

Per què són importants les dilucions seriades en el recompte de UFC?

Les dilucions seriades són crucials per obtenir plaques amb un nombre manejable de colònies (idealment entre 30 i 300). Això garanteix una precisió en el recompte, evitant errors causats per un excés o una manca de colònies a la placa.

Quina diferència hi ha entre la fase de latència i la fase estacionària en un cultiu?

La fase de latència és el període inicial d'adaptació on els microorganismes no es divideixen significativament. En canvi, la fase estacionària ocorre quan la taxa de creixement s'iguala a la taxa de mort cel·lular, o per l'esgotament de nutrients o acumulació de productes tòxics, i el nombre total de cèl·lules es manté constant.

Com puc convertir l'absorbància a concentració de cèl·lules?

Per convertir l'absorbància a concentració cel·lular, necessites una corba de calibratge prèviament establerta. Aquesta corba relaciona l'absorbància (mesurada amb un espectrofotòmetre a una longitud d'ona específica, sovint 600 nm) amb una concentració coneguda de cèl·lules (determinada per recompte en placa o cambra). Amb l'equació de la recta de regressió (y = mx + b), pots calcular la concentració (x) a partir de l'absorbància (y).

Què és la velocitat específica de creixement i per a què serveix?

La velocitat específica de creixement (µ) és la taxa a la qual una població microbiana creix en un moment donat, expressada com la fracció d'augment per unitat de temps. És fonamental per entendre la productivitat de cultius, optimitzar processos de fermentació i modelar el comportament microbià en diversos entorns.

Cinètica i Quantificació Microbiana